解毒通絡保腎法對實驗性DM大鼠腎足細胞凋亡相關因子Bax、Bcl-2、Caspase-3的影響

何澤 成光宇 呂美香 叢婷婷 吳春煒

(長春中醫藥大學附屬醫院 1內分泌代謝病科，吉林 長春 130021；2實驗中心；長春中醫藥大學3 2014級中西醫結合內科碩士研究生；4 2017級中醫內科碩士研究生)

足細胞為腎小球濾過屏障的重要組成部分，在維持腎小球濾過膜結構和功能上具有重要作用，在糖尿病(DM)及非DM腎小球疾病中，足細胞數量減少可直接引起蛋白尿及腎小球硬化，且足細胞數量的減少與腎小球硬化程度呈正相關〔1〕。細胞凋亡中起主要角色的是Bcl-2家族蛋白和半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(Caspase)家族蛋白。本文通過對實驗性DM大鼠腎臟中Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白的干預，觀察解毒通絡保腎法對實驗性DM大鼠腎臟足細胞的保護作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物與飼料 健康狀況良好的清潔級Wistar大鼠60只，雌雄各半，體重180～200 g，購于吉林省實驗動物中心。給予高糖高脂飼料(主要成分：基礎飼料59%、豬油18%、蔗糖20%、蛋黃3%)，實驗期間大鼠自由攝食和飲水。

1.2主要試劑和藥品 丹參、黃連、紅參、生地、黃芪、大黃、金蕎麥、枸杞、雙花、地龍(長春中醫藥大學附屬醫院中藥房)；鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司);枸椽酸、枸椽酸鈉(天津市光復科技發展有限公司)；精蛋白重組人胰島素注射液(通化東寶藥業股份有限公司)；葡萄糖注射液(河北天成藥業股份有限公司)。

1.3主要設備 血糖儀(三諾生物傳感股份有限公司)，醫用離心機(北京醫用離心機廠制造)，電動玻璃勻漿器(寧波新芝科研究所)，臺式冷凍高速離心機(Hesmal，德國)，生化自動分析儀(日本日立7150型)，全自動尿液分析儀(MA-4210，日本)，BSA124S-CW精密電子秤(賽多利斯科學儀器有限公司)，酶聯免疫吸附試驗試劑盒(美國Linco公司)，酶標儀(北京康富萊科技)。

1.4實驗動物模型的復制與分組 大鼠適應性喂養1 w，隨機分為陰性組(A組,n=10)，其余為造模組。喂養4 w后，造模組進行造模，用50 mg/kg STZ(臨用前用0.1 mol/L枸椽酸緩沖液溶解，pH4.3)單次腹腔注射。A組腹腔注射上述等體積檸檬酸緩沖液作為對照。注射STZ 3 d后檢測造模組尿糖和血糖，尿糖3+以上，血糖水平≥16.7 mmol/L，尿量和飲水量明顯增多者，列入DM觀察對象，共49只。將成模DM大鼠，隨機分為模型組(B組，n=24)、中藥組(C組，n=25)，進行灌胃。C組予中藥湯劑解毒通絡保腎散4.5 g/(kg·d)，1 ml/100 g，每日灌胃1次。A組及B組于每日相同時間灌胃相同體積無菌蒸餾水(1 ml/100 g)。

1.5腎臟標本及腎組織勻漿制備 所有實驗動物自由進食和飲水，每籠飼養5只大鼠，每3 d稱量體重1次，并觀察一般狀態。分別于第0、4、8 w檢測各組大鼠空腹血糖(FPG)。8 w末，大鼠單籠收集24 h尿液，檢測尿量、尿微量白蛋白(mALb)。最后一次給藥后禁食12 h，稱大鼠體重、麻醉，迅速解剖，腹主動脈取血，檢測血清肌酐(Scr)及尿素氮(BUN)，快速切除雙側腎臟，濾紙吸干，去掉包膜，用精密天平即刻稱重。取大鼠腎臟，剪取腎組織后稱重，按1:9濃度(W:V=1 g:9 ml)加入勻漿介質，電動玻璃勻漿器在 4℃條件下制備組織勻漿。3 000 r/min離心10 min，吸取上清液。

1.6Bax、Bcl-2、Caspase-3的檢測 采用酶聯免疫吸附試驗測定。設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50 μl；樣本孔先加待測樣本10 μl，再加樣本稀釋液40 μl，空白孔不加；除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體100 μl，用封板膜封住反應孔，37℃恒溫箱溫浴60 min。棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，重復洗5次；每孔加入底物A、B各50 μl，37℃避光孵育15 min；每孔加入終止液50 μl，15 min內，在450 nm波長處測定各孔的OD值。繪制標準曲線，將樣品孔的OD值帶入標準曲線方程，計算各樣本濃度。

1.7統計學方法 應用SPSS13.0軟件進行方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1各組血尿生化指標比較 B、C組第4、8周FPG、mAlb及Scr和BUN均顯著高于A組(P<0.05，P<0.01)。與B組比較，C組第4、8周FPG、mAlb及Scr和BUN均顯著降低(P<0.01,P<0.05)。見表1、2、3。

2.2各組Bax、Bcl-2及Bax/Bcl-2比較 與A組比較，B、C組Bax、Bax/Bcl-2明顯升高(P<0.01,P<0.05)，Bcl-2明顯降低(P<0.01，P<0.05)；與B組比較，C組Bax、Bax/Bcl-2明顯降低(P<0.01)，Bcl-2明顯升高(P<0.05)。見表4。

2.3各組Caspase-3水平比較 A、B、C組Caspase-3表達分別為：(44.26±5.09)pmol/L、(61.73±2.45)pmol/L、(54.13±6.25)pmol/L。與A組相比，B、C組Caspase-3表達明顯增加(P<0.01)；與B組相比，C組Caspase-3表達明顯降低(P<0.05)。

表1 各組0、4、8 w FPG比較

與A組比較:1)P<0.01；與B組比較：2)P<0.01，3)P<0.05，表2、3同

表2 各組Scr、BUN水平比較

表3 各組0、4、8 w mAlb比較

表4 各組腎Bax、Bcl-2及Bax/Bcl-2比較

與A組比較:1)P<0.01，2)P<0.05；與B組比較：3)P<0.01，4)P<0.05

3 討 論

DM高血糖、糖基化終末產物、氧化應激等多種因素作用于足細胞，使其發生不同形式的損傷，包括細胞肥大、足突融合、發育停滯、脫落、凋亡等，導致足細胞數目減少、腎小球濾過膜完整性破壞而出現蛋白尿。足突融合和消失是足細胞損傷的最后通路。裂孔隔膜破裂、骨架蛋白改變、腎小球基底膜(GBM)改變或足細胞附著在GBM上不緊密、足細胞及足細胞負電荷的中和等均可引起足突消失。

裂孔隔膜是血漿蛋白通過的最后屏障，也是腎小球濾過屏障的關鍵結構，與蛋白尿的發生關系密切，足突通過收縮和擴張能力，改變裂孔大小和濾過膜的面積，調節大小分子的選擇性濾過。裂孔隔膜由nephrin、podocin等許多分子組成，其中nephrin 是主要成分之一，是構成孔隔膜的分子基礎〔2〕。實驗表明，中藥芪衛顆粒〔3〕低、中、高劑量組與陽性組相比，均可上調裂孔隔膜蛋白nephrin的表達，減少足細胞損傷。

足細胞足突由細胞骨架肌動蛋白系統維護，足細胞肌動蛋白骨架是一個復雜的網絡結構，系統異常導致足突融合，而足突融合與蛋白尿緊密相關。α-actinin-4是一種廣泛表達的肌動蛋白交連蛋白，在維持足細胞正常形態、黏附、運動及與β1整合素的磷酸化等生物學功能上起重要作用。研究發現〔4〕，高糖可使足細胞 α-actinin-4表達減少，導致足細胞骨架破壞。榛花消腎安膠囊〔5〕能夠抑制實驗性DM大鼠腎組織α-actinin-4蛋白及mRNA的表達，改善實驗性 DM 大鼠腎臟組織的病理結構，改善足細胞狀態，抑制實驗性DM大鼠早期腎臟肥大，減少mAlb的排出，保護腎功能。

足細胞脫落與細胞基質黏附系統破壞密切相關。整合素是一類細胞膜上細胞基質黏附受體，結合GBM中特異性配體來維持足細胞的緊密附著。整合素a3β1位于足細胞足突基底外側，通過結合特異性配體、層黏連蛋白在GBM中被激活。整合素胞質區域結合多種胞內蛋白，這些胞內蛋白可以調節整合素和足細胞肌動蛋白系統。足細胞骨架蛋白-整合素系統失調將引起足細胞損傷〔6〕。骨架蛋白重新排列，表面負電荷減少和整合素表達減少等都是導致足細胞脫落的原因〔7〕。Roselli等〔8〕發現，高糖可抑制DM小鼠足細胞a3β1整合素的表達，并隨病程延長抑制作用加強，故推斷高糖可通過對a3β1整合素的抑制作用導致足細胞脫落及腎小球濾過屏障的功能變化。

Podocalyxin是足突頂膜區一種CD34相關的帶負電荷的跨膜蛋白，富含唾液酸和硫酸鹽成分，在足細胞表面形成多聚糖蛋白復合物，對維持足細胞的正常結構和濾過屏障功能起重要作用。Podocalyxin 表面電荷具有抗黏附作用，其正常表達能夠抵制相鄰足突間及其與基質間的黏附，維持其獨特的形態結構，防止帶負電荷的蛋白分子從裂孔隔膜中漏入原尿中。Economou等〔9〕主張在DM腎病(DN)可引起Podocalyxin表達下降，腎小球濾過電荷屏障減弱，損傷腎功，加快蛋白尿的出現及DN的進展，并通過體內外實驗證實高糖刺激后Podocalyxin的表達較陽性組下降。朱海慧等〔10〕發現清熱益氣通絡法的自擬中藥湯劑，與陽性對照組比，降低腎重，升高Podocalyxin 蛋白表達和降低Desmin表達，從而拮抗足細胞上皮間充質轉分化，減輕足細胞損傷，保護腎功能，降低Scr清除率、減輕腎臟肥大。細胞凋亡是受一系列連續基因調控的程序化反應，在凋亡過程中，Bcl-2 家族蛋白起重要調控作用，其作用為雙向的。Bcl-2家族可以分為兩類：一類是抗細胞凋亡基因，代表基因是Bcl-2基因，另一類是促細胞凋亡基因，代表基因是Bax基因，它是Bcl-2結合蛋白，是拮抗Bcl-2的促凋亡因子，與其有同源序列。隨Bcl-2蛋白表達量上升，越來越多的Bax二聚體分開，與Bcl-2形成比Bax-Bax更穩定的Bax-Bcl-2異源二聚體，從而“中和”Bax-Bax誘導凋亡的作用，Bcl-2通過與Bax結合抑制凋亡并促進細胞存活〔11〕。Bax與Bcl-2 的比值，決定細胞最終走向生存還是死亡，若Bax與Bcl-2的比值成上升趨勢則細胞走向生存，若Bax與Bcl-2的比值成下降趨勢，細胞走向凋亡。他們共同協調作用，激活下游基因，發揮調節作用。細胞凋亡有三條途徑，這三條凋亡途徑都是通過活化Caspase〔12〕，然后作用于底物蛋白,使蛋白分解而引起凋亡。Caspase-3是履行凋亡執行功能最主要的蛋白酶之一，位于Caspase級聯反應的最下游。通常認為Caspase-3是細胞凋亡蛋白酶級聯反應的必經之路，它的活化是凋亡進入不可逆階段的標志。Zehendner等〔13〕發現在急性腦缺血中，Caspase-3 被迅速激活，緊密連接蛋白的斷裂也隨之啟動，實驗肯定了Caspase-3在此過程中的重要作用。

解毒通絡保腎散由中藥大黃、黃連、黃芪等10味藥物組成，具有益氣養陰、活血化瘀、解毒通絡之功效。前期研究表明，中藥復方解毒通絡保腎散能夠改善實驗性 DM 大鼠一般狀況，調節糖脂代謝，抑制 DM 大鼠腎臟肥大及高濾過，減少尿蛋白的排出，保護腎小球結構和功能〔14〕；能夠抑制晚期糖基化終末產物形成，減少其介導的腎組織損傷〔15〕。本實驗結果提示解毒通絡保腎散降低實驗性DM大鼠FPG、Scr、BUN、mAlb，保護腎功能。本研究提示：腎臟Bax、Bcl-2、Caspase-3在DM大鼠腎臟中的表達明顯增多，與DM腎臟損害及mAlb的排泄密切相關，解毒通絡保腎法下調DM大鼠腎臟中Bax/Bcl-2的表達，繼而抑制下游反應，減少細胞凋亡執行蛋白酶Caspase-3產生，而抑制足細胞凋亡，保護腎小球濾過屏障，延緩病情發展。