黃芪糖蛋白對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化的干預(yù)作用及機(jī)制

欒智華 柴智 任晉宏 魏硯明 薛慧清 王瑞 方穎茵 武平

(山西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，山西 晉中 030619)

肺纖維化是以成纖維細(xì)胞大量增殖及細(xì)胞外基質(zhì)沉積，伴有炎性損傷、組織結(jié)構(gòu)破壞為特征的肺部疾病；損傷異常修復(fù)導(dǎo)致肺組織結(jié)構(gòu)異常，是嚴(yán)重影響人體肺功能的間質(zhì)性肺病〔1〕。特發(fā)性肺纖維化的發(fā)病率目前呈上升趨勢(shì)，多見(jiàn)于老年人，發(fā)病率男性略高于女性，自確診起，患者中位生存期小于3年。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前推薦治療方法為糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑治療，但效果不明顯，所以尋找安全有效的治療藥物仍是研究重點(diǎn)。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，從分子水平研究中藥及其有效成分的作用靶向已成為研究熱點(diǎn)。黃芪為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，黃芪味甘，性溫，歸肺、脾經(jīng)，具有益氣升陽(yáng)、固表止汗、利水消腫和托毒生肌的功效，是益氣扶正的代表藥物〔2〕。黃芪糖蛋白(HQGP)從傳統(tǒng)中藥膜莢黃芪中提取純化，體外實(shí)驗(yàn)表明其具有一定的免疫抑制作用〔3〕。HQGP具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用，但對(duì)肺纖維化的作用及其機(jī)制鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究國(guó)內(nèi)首次觀察了HQGP干預(yù)博萊霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化的病理改變及肺組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1表達(dá)。

1 材料與方法

1.1材料 SPF級(jí)雌性ICR小鼠，6～8周齡，體重16～18 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0011。HQGP由山西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心薛慧清教授惠贈(zèng)。注射用鹽酸博萊霉素，浙江海正輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)16033811。TGF-β1兔抗、即用型鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)免疫組化試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑，均購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。全自動(dòng)半封閉脫水機(jī)、輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、石蠟冷凍包埋機(jī)(德國(guó)徠卡)；病理圖文分析系統(tǒng)(Olympus)。

1.2實(shí)驗(yàn)分組 適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，將小鼠分為對(duì)照組、模型組及治療組。肺纖維化模型參照欒智華等〔4〕的方法，鼻腔滴注博萊霉素造模。建模后第2天起，對(duì)照組、模型組腹腔注射0.9%生理鹽水0.2 ml；治療組腹腔注射HQGP，劑量按照1 mg/kg，用0.9%生理鹽水稀釋?zhuān)?.2 ml，連續(xù)注射14 d。

1.3HE、Masson染色 各組分別于造模后第7、14、28天，每組取材5只，小鼠左肺以4%多聚甲醛固定，進(jìn)行常規(guī)脫水、透明、包埋，5 μm石蠟組織切片進(jìn)行 HE及Masson 染色。

1.4免疫組化染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，抗原修復(fù)，滴加單克隆TGF-β1 抗體，于 4℃過(guò)夜孵育，DAB顯色，蘇木素染液復(fù)染，中性樹(shù)膠封片，于顯微鏡下觀察TGF-β1表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1HE染色結(jié)果 對(duì)照組肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡腔內(nèi)無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔未增厚。模型組第7天可見(jiàn)肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡腔內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，伴有大量出血；第14天見(jiàn)肺泡腔內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔明顯增寬，成纖維細(xì)胞增殖；第28天大量成纖維細(xì)胞增殖、肺纖維化瘢痕形成。與模型組比較，治療組肺組織相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的肺泡炎程度明顯減輕，見(jiàn)圖1。

圖1 各組造模后各時(shí)間點(diǎn)肺組織病理學(xué)變化(×400)

2.2Masson染色結(jié)果 對(duì)照組肺泡間隔有少量膠原纖維分布。模型組肺組織第7天可見(jiàn)染成藍(lán)色的膠原纖維沉積，主要集中于終末支氣管壁及肺泡間隔；第14天膠原纖維進(jìn)一步沉積；第28天肺間質(zhì)中存在大量被染成藍(lán)色的膠原纖維，彌漫性纖維化組織形成。與模型組比較，治療組肺組織相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的纖維化程度明顯減輕，見(jiàn)圖1。

2.3各組肺組織TGF-β1表達(dá) TGF-β1陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，對(duì)照組細(xì)支氣管黏膜上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞胞質(zhì)有少量陽(yáng)性表達(dá)；模型組肺組織上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞中TGF-β1表達(dá)明顯增多；與模型組相比，治療組肺組織相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的肺組織中TGF-β1表明顯減少，見(jiàn)圖2。

圖2 各組造模后各時(shí)間點(diǎn)肺組織TGF-β1表達(dá)(免疫組化，×400)

3 討 論

肺纖維化是一組由已知或未知原因引起、以肺間質(zhì)慢性炎癥和大量膠原纖維沉積為病理特征的肺部疾病〔5〕，發(fā)病機(jī)制不清，且缺乏有效的治療手段。目前除了肺移植，尚無(wú)有效的抗纖維化藥物，患者中位生存期僅3～5年〔6〕。目前臨床上主要采用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑及抗纖維化制劑來(lái)治療肺纖維化，但療效差，安全性低，患者長(zhǎng)期應(yīng)用可出現(xiàn)副作用，故迫切需要開(kāi)發(fā)新的抗肺纖維化藥物。

糖蛋白是一類(lèi)由糖類(lèi)同多肽或蛋白質(zhì)以共價(jià)鍵連接而形成的結(jié)合蛋白，廣泛存在于動(dòng)物、植物和某些微生物中，且存在形式各不相同。山西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心從中藥黃芪中提取到一種具有免疫抑制活性的物質(zhì)——HQGP，并已申請(qǐng)專(zhuān)利〔7〕。趙俊云等〔8〕采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法觀察到HQGP可有效誘導(dǎo)佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織的細(xì)胞凋亡；章培軍等〔9〕利用HQGP治療實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)，推測(cè)其治療EAE的可能機(jī)制是抑制了炎癥反應(yīng)；張娜等〔10〕研究表明，HQGP對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)小鼠的治療作用可能是與降低特異性轉(zhuǎn)錄因子T細(xì)胞表達(dá)的T盒(T-bet)、結(jié)合蛋白(GATA)-3 表達(dá)，調(diào)整 Th1/Th2功能失衡有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HQGP對(duì)小鼠的肺纖維化具有一定治療作用。TGF-β1 是促進(jìn)肺纖維化的重要因子，可促進(jìn)膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過(guò)度沉積，而導(dǎo)致肺纖維化的產(chǎn)生〔11〕。本文結(jié)果表明，HQGP可以明顯減輕肺纖維化小鼠的肺泡炎及纖維化程度；HQGP可以明顯降低肺組織中TGF-β1的表達(dá)，從而延緩肺纖維化的進(jìn)程，這些作用機(jī)制的揭示為指導(dǎo)HQGP開(kāi)發(fā)及臨床用藥提供了可靠的藥理學(xué)依據(jù)。