組氨酸磷酸酶蛋白14對肺癌細胞皮下移植瘤生長及信號轉導與轉錄因子3磷酸化水平的影響

馬建欣 馬永新 熊勝春

(1承德市中心醫院心胸外科，河北 承德 067000；2承德市第三醫院腫瘤科)

研究肺癌的發病機制，尋找有效的靶基因提高腫瘤患者的生存率是目前研究的重點〔1，2〕。組氨酸磷酸酶蛋白(PHP)14是一種發現于高等脊椎動物中的PHP，目前對其生物學特性的研究較少，在肺癌中發現其表達水平高于正常組織，并且與肺癌患者的病理特征有關，通過小干擾核糖核酸(siRNA)技術下調肺癌細胞中PHP14的表達后，細胞的凋亡水平增加，推測其可能參與肺癌細胞的生物學特性的發揮〔3，4〕。本實驗旨在探討PHP14對肺癌細胞皮下移植瘤生長的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1主要材料 Balb/c-nu裸鼠購自承德醫學院實驗動物中心；Lipfectamine2000、Opti-MEMⅠReduced Serum Medium購自Invitrogen公司；RNA提取試劑盒購自MRC公司；RNA提取試劑盒、互補脫氧核糖核酸(cDNA)合成試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)試劑盒均購自大連寶生物公司；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)抗體、信號轉導與轉錄因子(STAT)3抗體購自美國CTS；磷酸化(p)-STAT3抗體、p-p38MAPK抗體、PHP14抗體購自美國BioVision；pSEB-HUS-PHP14 siRNA1、pSEB-HUS-PHP14 siRNA2由承德市中心醫院實驗室構建保存。

1.2細胞株 A549細胞在含有100 U/ml的鏈霉素及青霉素、10%胎牛血清的DMEM培養液中培養，在溫度為37℃，5% CO2培養箱內培養，每隔2～3 d進行傳代，傳代用0.25%的胰蛋白酶。

1.3細胞轉染 A549細胞以不同的處理方法分為對照組、陰性組、干擾1組、干擾2組。干擾1組、干擾2組細胞中分別轉染pSEB-HUS-PHP14 siRNA1和pSEB-HUS-PHP14 siRNA2，陰性組細胞中轉染含有sRNA的陰性對照的質粒，對照組細胞轉染時只加入轉染試劑。6孔培養板中每孔加入2 ml A549細胞懸浮液(約1.5×105個細胞)，孵育24 h至細胞融合度為60%，把250 μl的Opti-MEMⅠReduced Serum Medium同PHP14 sRNA和sRNA陰性對照混合后，再與Lipfectamine2000混合，室溫孵育15 min，每孔加入500 μl的上述混合物，孵育6 h，棄上清，更換細胞培養液，繼續孵育48 h。傳代后，用G418篩選穩定轉染的細胞株，擴大培養。

1.4qRT-PCR測定PHP14表達 取上述轉染后的對照組、陰性組、干擾1組、干擾2組細胞，用RNA提取試劑盒提取細胞中的總RNA，用M-MLV逆轉錄酶反轉錄合成cDNA，用qRT-PCR試劑盒分析PHP14表達水平。內參基因GAPDH引物序列：上游5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′，下游5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′。PHP14引物序列：上游5′-TCAGTAGCCGTCGTTAGCC-3′，下游5′-TGCGACTGTGAGTGTCTGGG-3′。

1.5Western印跡法測定PHP14表達 取上述轉染后的對照組、陰性組、干擾1組、干擾2組細胞，提取細胞中的總蛋白，步驟同試劑盒說明書。提取的各組蛋白樣品用二喹啉甲酸(BCA)法測定濃度后，每個泳道加40 μg蛋白樣品進行蛋白電泳，凝膠用10%分離膠、5%積層膠。蛋白樣品在上樣前進行變性處理(與等體積的2×上樣緩沖液煮沸5 min)；積層膠90 V電壓電泳，分離膠120 V電壓電泳；4℃，90 V，轉膜2 h；5%牛血清白蛋白室溫中封閉2 h，1∶600稀釋一抗，4℃過夜，與1∶2 000稀釋的二抗置于室溫中孵育2 h)。電化學發光法(ECL)檢測，用Image J軟件進行目的條帶定量分析，內參為GAPDH。

1.6噻唑藍(MTT)測定細胞體外增殖 對照組、陰性組、干擾1組細胞在轉染后24 h、48 h、72 h分別加入MTT溶液，培養4 h，棄上清，再添加150 μl的二甲基亞砜(DMSO)，孵育反應10 min，酶標儀檢測490 nm處的OD值。

1.7肺癌細胞皮下移植瘤實驗 Balb/c-nu裸鼠，體重18～22 g，4～6周齡，隨機分成3組。將上述對照組、陰性組、干擾1組細胞配制成細胞懸浮液，取100 μl的細胞懸浮液(含5×106個細胞)種植到裸鼠右前肢皮下，分別在7 d、14 d、21 d、28 d用游標卡尺測量腫瘤的長度和寬度，計算腫瘤體積。并在28 d處死各組裸鼠，測定皮下移植瘤的重量，同時取腫瘤組織，用Western印跡法檢測組織中的STAT3、p38MAPK、p-STAT3、p-p38MAPK蛋白水平，步驟同1.5。

1.8統計分析 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1轉染后各組肺癌細胞中PHP14 mRNA和蛋白的表達 干擾1組、干擾2組肺癌細胞中的PHP14 mRNA和蛋白水平均明顯低于對照組(P<0.05)，且干擾1組顯著低于干擾2組(P<0.05)，陰性組與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。PHP14 siRNA可以沉默肺癌細胞中PHP14 mRNA的表達，選取干擾效果更好的PHP14 siRNA1做后續研究。見表1。

表1 siRNA轉染后各組肺癌細胞PHP14的表達

與對照組比較：1)P<0.05；與干擾1組比較：2)P<0.05

2.2沉默PHP14對肺癌細胞體外增殖的影響 與對照組比較，24 h開始干擾1組肺癌細胞OD值明顯降低(P<0.05)，而陰性組OD值差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 下調PHP14后各時點各組肺癌細胞體外增殖情況

與對照組比較：1)P<0.05；下表同

2.3沉默PHP14對肺癌細胞皮下移植瘤生長的影響 干擾1組肺癌細胞皮下移植瘤體積顯著小于對照組(P<0.05)，28 d時腫瘤重也顯著小于對照組(P<0.05)，而陰性組肺癌細胞腫瘤體積和腫瘤重量與對照組差異均無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 下調PHP14后各時點各組肺癌細胞皮下移植瘤的體積及瘤重

2.4沉默PHP14對肺癌細胞皮下移植瘤中STAT3、p38MAPK磷酸化的影響 沉默PHP14后肺癌細胞p-STAT3、p-p38MAPK表達顯著低于STAT3、p38MAPK，見圖1。干擾1組肺癌細胞皮下移植瘤中p-STAT3/STAT3水平顯著降低、p-p38MAPK/p38MAPK水平顯著升高(均P<0.05)，而陰性組與對照組差異均無統計學意義(P>0.05)。見表4。

圖1 Western印跡法檢測各組皮下移植瘤組織中STAT3和p38MAPK磷酸化水平

組別p-STAT3/STAT3p-p38MAPK/p38MAPK對照組0.30±0.050.23±0.02陰性組0.29±0.060.22±0.04干擾1組0.12±0.021)0.53±0.061)F/P值14.169/0.00549.875/0.000

3 討 論

腫瘤的發生機制較為復雜，是一個多基因共同參與調控的過程，目前為止，已經發現了多個與肺癌相關的基因，在腫瘤組織中發揮抑制或促進作用，具有調控細胞不同生物學特性的功能〔5～8〕。PHP14是發現的第一個存在于哺乳動物中的PHP，目前發現了很多與組氨酸磷酸化相關的蛋白參與腫瘤細胞的相關生物學特性過程中，PHP14可能也參與腫瘤的發生〔9，10〕。在肺癌組織中的研究表明，PHP14在腫瘤中高表達，在35例肺癌組織中有約65%的組織中存在PHP14 mRNA的高表達，并且與腫瘤患者的臨床特征有關〔3，11〕。在肺癌細胞中下調PHP14表達后，經流式細胞術測定發現，肺癌細胞凋亡率明顯升高〔4〕。本研究表明，PHP14沉默后的肺癌細胞的體外增殖能力降低，提示PHP14在肺癌發生中可能發揮抑制作用。腫瘤的生長與腫瘤細胞異常增殖有關，是腫瘤無限惡性增殖的結果。腫瘤的生長是一個多種基因、多步驟調控的復雜過程，除了與細胞內基因調控、信號轉導等有關外，還與細胞生長的微環境有關，裸鼠皮下成瘤是常用的檢測細胞生物學特性的模型，也是常用的檢測抗腫瘤藥物或癌基因、抑癌基因對腫瘤生長、轉移等作用的體內模型〔11～14〕。本研究表明，沉默PHP14表達后可以在體內抑制肺癌細胞的生長。

STAT3信號通路是一種廣泛存在于哺乳動物體內的信號轉導通路，其激活水平的高低與胚胎發育、神經生長等有關，在心血管系統疾病、呼吸系統疾病、消化系統疾病等多種疾病的發生過程中發揮重要作用〔15～17〕。STAT3信號通路與腫瘤發生有關，在腫瘤組織中異常激活，而在正常的組織中激活水平較低，STAT3只有在磷酸化后才可發揮其生物學特性，影響細胞的生長等過程〔18，19〕。p38MAPK信號通路是MAPK的分支，其磷酸化水平升高后可以抑制細胞的增殖，在腫瘤組織中激活水平較低，激活p38MAPK信號通路可抑制腫瘤細胞的生長〔20～22〕。本研究說明沉默PHP14抑制了移植瘤中STAT3信號通路的激活，促進了p38MAPK信號通路的激活。

PHP14參與肺癌發生過程，與肺癌細胞生長有關，其作用機制可能與STAT3和p38MAPK信號通路有關，PHP14可能是基因靶向治療的潛在靶點。