2型糖尿病合并結(jié)腸癌老年患者腫瘤組織中晚期糖基化終產(chǎn)物受體及轉(zhuǎn)化生長因子-β1的表達及臨床意義

劉瑩 蔣敦科 李素艷 井潔 林瑤光

(廣西醫(yī)科大學 1第一附屬醫(yī)院老年消化內(nèi)科,廣西 南寧 530021；2第二附屬醫(yī)院老年消化內(nèi)科)

近年來，糖尿病與惡性腫瘤之間的關(guān)系越來越受到研究者的關(guān)注〔1〕。據(jù)統(tǒng)計在2型糖尿病患者伴發(fā)的惡性腫瘤中，消化系統(tǒng)腫瘤發(fā)病率為33.9%，居于首位，而其中結(jié)直腸癌發(fā)病率為7.68%，處于消化系統(tǒng)腫瘤的第2位，與非糖尿病人群相比發(fā)病風險大幅提高〔2〕。糖尿病，特別是2型糖尿病患者結(jié)腸癌發(fā)病風險升高的機制尚不完全清楚，但一般認為可能與機體長期處于高血糖狀態(tài)導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)增強及機體免疫功能底下有關(guān)，前者可促進炎癥因子釋放誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生，后者可導(dǎo)致腫瘤細胞難以被免疫系統(tǒng)消滅〔3〕。2型糖尿病患者體內(nèi)中晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)及其受體(RAGE)在高血糖導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。研究表明，AGEs可憑借RAGE進入巨噬細胞及中性粒細胞，刺激氧自由基的產(chǎn)生，進而促進包括轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1在內(nèi)的多種細胞因子的釋放〔4〕。TGF-β1是一種重要的上皮細胞生長負性調(diào)控因子，在包括結(jié)腸癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤細胞中高表達〔5〕。本文擬進一步探討AGEs-RAGE及TGF-β1在2型糖尿病患者結(jié)腸癌腫瘤發(fā)生中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2012年1月至2015年5月在廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科住院治療的120例結(jié)腸腫瘤老年患者的臨床資料。納入標準：①納入病例均經(jīng)手術(shù)或結(jié)腸鏡取標本進行組織病理學檢查后確診，糖尿病患者符合WHO糖尿病診斷標準〔6〕；②獲取標本前，患者未接受放、化療或靶向治療；③無其他系統(tǒng)惡性腫瘤，未發(fā)生惡病質(zhì)、嚴重感染等并發(fā)癥。排除標準：①患有1型糖尿病，妊娠期糖尿病或內(nèi)分泌疾病所致糖尿病；②伴有嚴重心、肝、腎疾病或免疫系統(tǒng)疾病。按是否患有糖尿病及腫瘤的病理組織學類型分為糖尿病合并結(jié)腸癌組、結(jié)腸癌組及結(jié)腸腺瘤組，每組40例。糖尿病合并結(jié)腸癌組男29例，女11例，年齡61～81歲，平均(73.7±4.3)歲；結(jié)腸癌組男30例，女10例，年齡68～79歲，平均(74.4±4.5)歲；結(jié)腸腺瘤組男31例，女9例，年齡67～77歲，平均(72.0±5.2)歲。三組性別及年齡等一般資料分布差異無統(tǒng)計學意義，具有可比性(P>0.05)。患者及家屬對研究的目的和方法知情同意并書面簽字。

1.2檢測方法 采用免疫組化法檢測結(jié)腸病理組織標本中RAGE及TGF-β1表達水平。兔抗人多克隆RAGE抗體(貨號PB0530)、兔抗人多克隆TGF-β1抗體(貨號A00019)及免疫組化全套試劑均購自武漢博士德公司。實驗方法：將病理石蠟切片脫蠟置水后使用0.3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，使用10%的即用型血清封閉抗原，加入1∶100稀釋的一抗于4℃過夜，第二日復(fù)溫1 h，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗后滴加辣根過氧化物酶標記的小鼠抗兔二抗，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色后于顯微鏡下觀察，PBS終止顯色，蘇木素復(fù)染胞核，梯度酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封片。每例設(shè)蘇木素-伊紅(HE)染色片及PBS代替一抗的陰性對照片供觀察，陽性對照片由博士德公司提供。根據(jù)陽性細胞比例和著色程度，采用半定量法〔7〕對目的抗原在腫瘤組織中的表達情況進行定量分析：在顯微鏡高倍鏡下(×200)隨機選擇5個視野，每個視野計數(shù)100個細胞，計算陽性細胞比例，陽性細胞數(shù)<5%計0分，5%～24%計1分，25%～50%計2分，51%～74%計3分，≥75%計4分；觀察切片陽性細胞著色強度，無色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分；將這兩項得分相加后判定最終表達情況，0分為陰性(-)，1～2分為弱陽性(+)，3～5 分為中等陽性()，6～7 分為強陽性()。

1.3隨訪 通過電話、信件、電子郵件、微信及QQ等多種方式對患者病情預(yù)后進行隨訪，隨訪截止期為2017年5月，隨訪間隔為3個月。

1.4統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0軟件，計數(shù)資料采用χ2檢驗、Fisher確切概率法檢驗或Kruskal-Wallis秩和檢驗，表達水平與臨床資料之間相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性檢驗，行Kaplan-Meier生存曲線分析。

2 結(jié) 果

2.1RAGE及TGF-β1在組織標本中的表達情況 RAGE及TGF-β1在結(jié)腸癌及結(jié)腸腺瘤組織中均有表達，且主要定位于腫瘤細胞質(zhì)內(nèi)；三組RAGE及TGF-β1表達差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，糖尿病合并結(jié)腸癌組中RAGE及TGF-β1陽性率與結(jié)腸癌組及結(jié)腸腺瘤組相比差異均具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，見圖1，圖2，表1。

圖1 各組RAGE的表達(DAB，×200)

圖2 各組VEGF的表達(DAB，×200)

2.2RAGE及TGF-β1表達的相關(guān)性 RAGE及TGF-β1的表達在80例結(jié)腸癌組織標本中存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.341，P=0.002)，見表2。

2.3RAGE及TGF-β1的表達與臨床資料的關(guān)系 RAGE、TGF-β1表達與結(jié)腸癌分化程度低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性、臨床分期(Duke分期)C期以上，細胞免疫功能低下(外周血T細胞總數(shù)及CD4+T細胞減少)、患者發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移及生存期較短有關(guān)(P<0.05)，與年齡(≥70歲)、腫瘤直徑(≥4 cm)及癌細胞浸潤達漿膜層無關(guān)(P>0.05)，見表3。

2.4RAGE及TGF-β1表達與生存期的關(guān)系 對全部患者隨訪至少2年，統(tǒng)計患者死亡時間，并根據(jù)RAGE及TGF-β1表達情況進行分析，Kaplan-Meier生存曲線分析表明RAGE及TGF-β1均無表達患者中位生存期為20.6個月，單基因表達陽性者中位生存期為16.3個月，RAGE及TGF-β1均陽性患者中位生存期為5.9個月，組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

表1 RAGE及TGF-β1在三組的表達情況(n,n=40)

表2 RAGE及TGF-β1在結(jié)腸癌組織中表達相關(guān)性(n,n=80)

表3 RAGE及TGF-β1表達與臨床資料之間的關(guān)系〔n(%)〕

1)Fisher確切概率法

圖3 RAGE及TGF-β1表達與患者生存期之間的關(guān)系

3 討 論

糖尿病是一種由胰島素分泌相對或絕對不足導(dǎo)致慢性血糖升高，從而引起機體營養(yǎng)及代謝紊亂，能夠累及全身所有系統(tǒng)的內(nèi)分泌-代謝性疾病，其發(fā)病率及各類相關(guān)并發(fā)癥發(fā)病率在我國有逐步上升的趨勢〔8〕。美國糖尿病學會及美國癌癥學會聯(lián)合發(fā)布的報告指出，糖尿病可增加肝癌、結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病風險，原因可能與患者不健康的生活方式有關(guān)〔9〕。隨著經(jīng)濟發(fā)展水平的提高，我國在糖尿病患病人口不斷增加的同時，結(jié)腸癌發(fā)病率和死亡率也不斷攀升〔10〕。糖尿病患者體內(nèi)的高血糖不僅可以為腫瘤細胞快速復(fù)制和遠處轉(zhuǎn)移提供足夠的能量支持，還可以通過將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸而引起正常細胞壞死、凋亡及膠原降解，進而促進腫瘤細胞的遷移〔11，12〕。

綜上所述，RAGE應(yīng)該作為結(jié)腸癌特別是合并糖尿病的老年患者的重要治療靶點而引起臨床重視。本研究也存在不足之處，例如僅從組織學角度對RAGE及TGF-β1表達的臨床意義進行分析，沒有體外細胞學、分子生物學實驗數(shù)據(jù)的進一步支持，這將是未來進一步的研究方向。