9p21染色體位點(diǎn)基因表達(dá)水平與冠心病病情發(fā)展的相關(guān)性

李勇 楊特 王銘 蔣嘉輝 郭前芳 李清梁

(重慶市中醫(yī)院心血管內(nèi)科，重慶 400021)

一般認(rèn)為冠心病與年齡、肥胖、高血壓、高血糖、生活習(xí)慣等有關(guān)，但僅可解釋約60%的發(fā)病病機(jī)〔1～4〕。隨著近年來(lái)基因?qū)W技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)基于基因表達(dá)改變的遺傳因素也是冠心病發(fā)生發(fā)展的主要病機(jī)，且基因?qū)W研究成為冠心病病機(jī)病理研究中的熱點(diǎn)問題〔5〕。Shea 等〔6〕首次報(bào)道了細(xì)胞周期依賴性激酶抑制基因(CDKN)2A、CDKN2B、甲硫腺苷磷酸化酶(MTAP)、INK4基因座中反義非編碼NRA(ANRIL)為白種人冠心病患者的易感位點(diǎn)基因，由于這些基因均屬于9p21染色體位點(diǎn)的相關(guān)基因，由此拉開了9p21染色體位點(diǎn)基因研究的序幕。由于基因存在人種易感差異性，而國(guó)內(nèi)尚少見9p21染色體區(qū)域基因表達(dá)與冠心病病情發(fā)展相關(guān)性的系統(tǒng)研究報(bào)道。本研究主要觀察9p21染色體位點(diǎn)相關(guān)基因與冠心病病情發(fā)展的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1對(duì)象及分組 本研究樣本選取及實(shí)驗(yàn)檢測(cè)均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。健康人群組來(lái)自于重慶市中醫(yī)院2018年1～4月的健康體檢人群30例，均為漢族，且經(jīng)病史問詢、體檢確定為非冠心病病人，同時(shí)本人及家屬直系三代無(wú)冠心病史。病例組來(lái)源于同期收治的冠心病患者90例，其中穩(wěn)定型心絞痛患者、不穩(wěn)定型心絞痛患者、急性心肌梗死患者各30例。病例組入選標(biāo)準(zhǔn)：①臨床表現(xiàn)符合冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)〔7〕；②漢族且無(wú)血緣關(guān)系；③冠狀動(dòng)脈造影至少1支以上冠狀動(dòng)脈狹窄50%以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：①擴(kuò)展型心臟病、風(fēng)濕性心臟病等心臟疾病患者；②嚴(yán)重肝腎疾病患者；③已經(jīng)接受靜脈溶栓治療和心臟手術(shù)者；④本人及家族直系三代冠心病史者。穩(wěn)定型心絞痛組、不穩(wěn)定型心絞痛組、急性心肌梗死組、健康人群組患者基線資料比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見表1。

表1 各組基線資料比較

1.2實(shí)驗(yàn)方法 經(jīng)研究對(duì)象知情同意后，采集空腹抗凝靜脈血2 ml，實(shí)驗(yàn)室測(cè)定9p21染色體位點(diǎn)CDKN2A、CDKN2B、MTAP和ANRIL基因表達(dá)水平。

1.2.1外周血總RNA提取實(shí)驗(yàn)。采用Trizol法提取外周血RNA。主要步驟：①新鮮血液標(biāo)本2 ml置于離心管，紅細(xì)胞裂解液(劑量4 ml)混勻后，4℃環(huán)境下12 000 r/min離心處理(持續(xù)時(shí)間2 min)后，棄上清紅色溶液；②再加入紅細(xì)胞裂解液(劑量4 ml)混勻后，4℃環(huán)境下12 000 r/min離心處理(持續(xù)時(shí)間2 min)后，棄上清紅色溶液；③再加入磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液(劑量4 ml)混勻后，4℃環(huán)境下作12 000 r/min離心處理(持續(xù)時(shí)間2 min)后，棄上清溶液；④再加入Trizol溶液(劑量4 ml)混勻，室溫下靜置10 min后加入三氯甲烷(劑量0.2 ml)混勻后，4℃環(huán)境下作12 000 r/min離心處理(持續(xù)時(shí)間15 min)后，棄上清液體；⑤再加入1 ml的70%乙醇(劑量1 ml)旋轉(zhuǎn)洗滌，4℃環(huán)境下作12 000 r/min離心處理(持續(xù)時(shí)間5 min)，加入焦碳酸二乙酯水(DEPC，劑量30 ml)融解沉淀，即可得到外周血總RNA提取液。

1.2.2外周血cDNA合成 反轉(zhuǎn)錄體系配置：①無(wú)RNA酶水(20 μl)；②TM緩沖液×5(1 μl)；③混合逆轉(zhuǎn)錄酶Ⅰ(1 μl)；④寡核苷酸(1 μl)；⑤6核苷酸的隨機(jī)引物(1 μl)；⑥總RNA(500 ng)。將外周血總RNA提取液2 ml與反轉(zhuǎn)錄體系溶液混勻，且在反應(yīng)條件(37℃ 10 min；85℃ 10 s；4℃ 1 h)下可合成得到外周血cDNA。

1.2.3引物設(shè)計(jì)及表達(dá)量測(cè)定。以CDKN2A、CDKN2B、MTAP和ANRIL基因作為9p21染色體位點(diǎn)候選基因，β-actin作為內(nèi)參基因，采用primer5.0標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物序列見表2，引物合成由本院實(shí)驗(yàn)室送寶生物工程有限公司合成。

表2 相關(guān)候選基因及內(nèi)參基因引物序列

合成物在實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增儀中(條件95℃ 30 s；95℃ 5 s；60℃ 20 s)進(jìn)行反應(yīng)，循環(huán)40次后，測(cè)定CDKN2A、CDKN2B、MTAP和ANRIL基因的mRNA表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行χ2、LSD-t檢驗(yàn)，方差分析。

2 結(jié) 果

2.1冠心病病情分期與CDKN2A位點(diǎn)基因表達(dá)水平的相關(guān)性 穩(wěn)定型心絞痛組、不穩(wěn)定型心絞痛組和急性心肌梗死組CDKN2A基因表達(dá)水平均顯著低于健康人群組(均P<0.05)。不同冠心病病情分期CDKN2A基因表達(dá)水平兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表3。

2.2冠心病病情分期與MTAP位點(diǎn)基因表達(dá)水平的相關(guān)性 穩(wěn)定型心絞痛組、不穩(wěn)定型心絞痛組和急性心肌梗死組患者M(jìn)TAP基因表達(dá)水平均顯著高于健康人群組(均P<0.05)。不同冠心病病情分期患者M(jìn)TAP基因表達(dá)水平兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表3。

2.3冠心病病情分期與CDKN2B位點(diǎn)基因表達(dá)水平的相關(guān)性 穩(wěn)定型心絞痛組、不穩(wěn)定型心絞痛組和急性心肌梗死組CDKN2B基因表達(dá)水平均顯著低于健康人群組(均P<0.05)。不同冠心病病情分期患者CDKN2B基因表達(dá)水平兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表3。

2.4冠心病病情分期與ANRIL位點(diǎn)基因表達(dá)水平的相關(guān)性 各組ANRIL基因表達(dá)水平兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表3。

表3 各組CDKN2A、MTAP、CDKN2B、ANRIL位點(diǎn)基因表達(dá)水平比較

與健康人群組比較：1)P<0.05；與穩(wěn)定型心絞痛組比較：2)P<0.05；與不穩(wěn)定型心絞痛組比較：3)P<0.05

3 討 論

基因研究是當(dāng)前冠心病病因病理的研究熱點(diǎn)。臨床研究顯示：家族聚集性是冠心病遺傳病因病理的重要特征，直系三代內(nèi)有冠心病史人群的冠心病患病風(fēng)險(xiǎn)是直系三代內(nèi)無(wú)冠心病史人群的12倍，且冠心病遺傳病因病理具有明顯的種族差異性〔8〕。Leander等〔9〕研究顯示，冠心病雖然具有復(fù)雜的多種致病基因，但其基因質(zhì)量性變異并不符合孟德爾遺傳特征，而是存在著數(shù)量級(jí)差的變異，通俗的說(shuō)就是冠心病病情發(fā)生發(fā)展可能存在多個(gè)易感區(qū)域。由于冠心病病因病理基因研究頗為復(fù)雜，基于候選基因策略的基因組關(guān)聯(lián)研究法成為研究主要方法，其通過對(duì)比分析冠心病人群和健康人群之間基因表達(dá)差異來(lái)確定疾病相關(guān)致病基因，同時(shí)也可通過對(duì)比分析冠心病不同病情發(fā)展人群之間基因表達(dá)變異差異來(lái)分析促使病情發(fā)展的相關(guān)基因〔10〕。由于基于候選基因策略的基因組關(guān)聯(lián)研究法，不需要具體了解候選基因具體作用機(jī)制，只需要了解致病基因所處位點(diǎn)，就可通過基因表達(dá)檢測(cè)技術(shù)來(lái)展開研究，使該方法在冠心病病情發(fā)生發(fā)展易感區(qū)域致病基因研究中應(yīng)用越來(lái)越廣泛。

當(dāng)前，國(guó)外學(xué)者采用基于候選基因策略的基因組關(guān)聯(lián)研究法已經(jīng)發(fā)生較多與冠心病病情發(fā)生發(fā)展相關(guān)易感區(qū)域，這無(wú)疑是冠心病病因病機(jī)基因研究中的一個(gè)巨大進(jìn)步，其中9p21染色體位點(diǎn)是最新研究發(fā)現(xiàn)的冠心病病因病機(jī)易感基因區(qū)域。21世紀(jì)初《Science》首次報(bào)道9p21染色體位點(diǎn)是白種人群冠心病易感基因位點(diǎn)以來(lái)〔11〕，加拿大、英國(guó)學(xué)者相繼發(fā)布類似報(bào)道〔12〕。2013年法國(guó)、德國(guó)、日本等6國(guó)成立國(guó)際合作研究小組，分別對(duì)本國(guó)冠心病人群與9p21染色體區(qū)域基因的相關(guān)性進(jìn)行研究，并印證了9p21染色體區(qū)域基因與冠心病病情發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔13〕。9p21染色體位點(diǎn)基因存在高度不平衡特性，其中CDKN2A、CDKN2B、ANRIL 和MTAP是臨床基因研究中的最熱基因。

CDKN2A、CDKN2B均屬于9p21染色體位點(diǎn)的周期編碼基因，在細(xì)胞運(yùn)行周期中具有抑制細(xì)胞活性作用，且是冠心病動(dòng)脈粥樣硬化的重要相關(guān)基因〔14〕。已有研究顯示，CDKN2A、CDKN2B基因主要位于9p21染色體位點(diǎn)上游部分，且為白種人群冠心病的致病基因〔15，16〕。ANRIL基因?yàn)橐环N反義非編碼RNA基因，其主要表達(dá)于血管巨噬細(xì)胞、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊細(xì)胞9p21染色體位點(diǎn)下游部分，其可通過轉(zhuǎn)錄控制來(lái)激活血管巨噬細(xì)胞、血管上皮組織細(xì)胞增殖通路相關(guān)基因的高表達(dá)〔17〕。有文獻(xiàn)研究顯示ANRIL與冠心病動(dòng)脈粥樣硬化病情發(fā)展密切相關(guān)，推測(cè)ANRIL可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展〔18〕。MTAP 基因?qū)儆?p21染色體位點(diǎn)關(guān)聯(lián)基因，在機(jī)體MTAP代謝功能中具有重要作用，且MTAP基因的多態(tài)性與冠心病患者心肌梗死的發(fā)生密切相關(guān)〔19〕。本研究結(jié)果提示，9p21染色體區(qū)域的CDKN2A、CDKN2B、MTAP基因與冠心病發(fā)生密切相關(guān)，且隨著冠心病病情發(fā)展，9p21染色體區(qū)域的CDKN2A、CDKN2B、MTAP基因表達(dá)與正常健康人群差異越明顯，9p21染色體位點(diǎn)CDKN2A、CDKN2B、MTAP基因表達(dá)水平可能是漢族冠心病人群臨床診治的潛在靶基因。這可能與上文闡述的CDKN2A基因和CDKN2B基因在細(xì)胞運(yùn)行周期中具有抑制細(xì)胞活性作用有關(guān)，也可能與ANRIL基因提示使患者M(jìn)TAP代謝功能受到抑制有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，ANRIL基因可能與冠心病病情發(fā)生發(fā)展無(wú)相關(guān)性，這與國(guó)外研究不吻合〔20〕，其原因可能在于本研究中的人種選擇差異或本研究中的病例樣本較小，這仍需下一步研究證實(shí)。

綜上所述，冠心病已經(jīng)是全球所關(guān)注的重大公共衛(wèi)生問題，其病因病理基因研究是當(dāng)前熱點(diǎn)研究方向。9p21染色體區(qū)域的CDKN2A、CDKN2B、MTAP、ANRIL等基因與白種人群冠心病病情發(fā)生發(fā)展相關(guān)，但本研究?jī)H研究顯示漢族人群冠心病病情發(fā)生發(fā)展與CDKN2A基因、CDKN2B基因表達(dá)下降和MTAP 基因表達(dá)提升密切相關(guān)，9p21染色體位點(diǎn)CDKN2A、CDKN2B、MTAP基因表達(dá)水平可能是漢族冠心病人群臨床診治的潛在靶基因。