無刺蜂蜂膠乙醇提取物的體外抗氧化及抗炎活性

王蓓，常化松，蘇松坤，孫麗萍，王凱

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無刺蜂蜂膠乙醇提取物的體外抗氧化及抗炎活性

王蓓1,2，常化松2，蘇松坤1，孫麗萍2，王凱2

（1福建農林大學蜂學學院，福州 350002；2中國農業科學院蜜蜂研究所，北京 100093）

【目的】無刺蜂(stingless bees)是熱帶和亞熱帶地區重要的授粉昆蟲之一，以尾部無蟄針為典型特征，其蜂膠采集量較意大利蜜蜂（）更多，然而其蜂膠活性研究卻相對匱乏。本文以來源于馬來西亞無刺蜂 ()采集蜂膠的乙醇提取物(ethanol extract ofpropolis, EEHI)為研究對象，旨在探究其體外抗氧化和抗炎活性。【方法】采用福林酚法和硝酸鋁法測定EEHI中總酚酸和總黃酮含量，并采用DPPH和ABTS+·自由基清除能力評價EEHI的體外抗氧化能力；在此基礎上，采用細菌脂多糖(LPS)誘導小鼠巨噬細胞RAW 264.7炎癥模型，通過CCK-8法檢測EEHI對細胞相對存活率的影響，在保證EEHI對細胞無細胞毒性作用基礎上，分別采用Griess法和實時熒光定量PCR（RT-qPCR）技術評估EEHI對LPS誘導的RAW 264.7細胞中炎癥介質一氧化氮（NO）釋放量的影響以及其對炎癥因子（、和）和抗氧化基因（）信使RNA表達的影響；進一步利用免疫印跡和免疫熒光方法，以NF-κB炎癥信號通路為切入點，研究EEHI對LPS誘導巨噬細胞中p-IκΒ和IκΒ蛋白表達以及NF-κB-p65蛋白移位的影響，從而探究EEHI潛在的抗炎機理。【結果】EEHI中總酚酸和總黃酮含量分別為54.70 mg GAE·g-1和116.20 mg QE·g-1；DPPH和ABTS+·自由基清除能力IC50值分別為275.60和 284.00μg·mL-1。EEHI對RAW 264.7細胞的安全濃度為0—40 μg·mL-1。在LPS誘導的Raw 264.7細胞炎癥模型中，相對于LPS刺激組，0—40 μg·mL-1的EEHI以濃度依賴方式顯著地抑制了LPS誘導的RAW 264.7細胞中NO的釋放量，且降低了細胞中炎癥因子、和的基因表達量，并增強了抗氧化基因的表達。進一步研究發現，0—40 μg·mL-1的EEHI以濃度依賴方式顯著抑制了LPS誘導的RAW 264.7細胞IκΒ蛋白的磷酸化，且40 μg·mL-1的EEHI顯著降低了NF-κB-p65蛋白的核移位現象，因此推測EEHI可能是通過抑制LPS誘導的NF-κB信號通路的激活進而發揮了體外抗炎活性。【結論】無刺蜂蜂膠乙醇提取物中含有大量多酚類化合物，具有較好的抗炎和抗氧化效果，極具開發利用價值。

無刺蜂; 無刺蜂蜂膠；抗氧化；抗炎；NF-κB

0 引言

【研究意義】無刺蜂（stingless bees）是熱帶和亞熱帶地區重要的授粉昆蟲之一，其區別于意大利蜜蜂（）的主要特征是尾部無蟄針[1]。無刺蜂蜂種繁多，是最具有代表性的一種，該種無刺蜂主要分布于熱帶和亞熱帶雨林氣候地區，其蜂膠年產量遠大于意大利蜜蜂，且膠源植物來源廣泛，生物學活性多樣，具有很高的生產價值和發展空間[2-3]。明確無刺蜂蜂膠（geopropolis）的體外抗氧化和抗炎效果，對進一步研究其生物學活性及特色蜂產品開發具有重要意義。【前人研究進展】無刺蜂蜂膠是由無刺蜂采集植物樹脂并混合蜂蠟以及泥土等制成的具有不同顏色的固體膠狀物，其在蜂箱中主要用來筑巢、填補蜂箱縫隙以及防御病蟲害入侵[1]。無刺蜂蜂膠作為一種民間藥物，在熱帶地區一直用于修復傷口，治療消化、呼吸、皮膚疾病，并用作抗菌劑和防腐劑等[4-5]，具有豐富的藥理學活性，如抗炎[6]、抗氧化[4]、抑菌[7]、抗癌[8]、抗病毒[9]、鎮痛[1]等。無刺蜂蜂膠主要含有苯丙酯類、黃酮類、酚酸類、可水解鞣質、三萜類、皂苷類以及生物堿類化合物，其中酚酸類、黃酮類和萜烯類化合物是其主要成分[10]。通過薄層色譜分析發現，蜂膠甲醇提取物中含有萜烯類、黃酮類、酚酸類、類固醇、皂角苷和香豆素類化合物[8,11]。筆者課題組前期通過UHPLC-Q-TOF/MS聯用技術分析蜂膠乙醇提取物，發現含有沒食子酸、咖啡酸、香草酸、苯甲酸、短葉松素、山奈酚、倒捻子素等多種酚酸、黃酮類和豐富的萜烯類化合物[12]。近年來，大量研究證明意大利蜜蜂蜂膠（主要是中國楊樹型蜂膠、巴西酒神菊屬型蜂膠）的抗氧化、抗炎活性與蜂膠中的酚酸類和黃酮類化合物密切相關，如山奈酚、咖啡酸苯乙酯、槲皮素、阿替匹林-C等[13]。炎癥是機體在受到外界刺激下引起的一系列免疫應激反應，通過調節相關的炎癥介質和細胞因子能夠有效地緩解炎癥反應，如、、等[14]。進一步研究證明蜂膠中的活性物質主要通過調節花生四烯酸代謝、L-精氨酸、抑制NF-κB等炎癥相關信號通路實現其抗炎活性，其中核轉錄因子NF-κB是巨噬細胞炎癥過程主要的信號通路，NF-κB被激活會造成促炎因子高表達[13,15]。筆者課題組前期研究發現富含多酚的中國蜂膠能夠通過調節炎癥相關因子（、、等）的表達，抑制脂多糖（LPS）誘導的巨噬細胞IκΒα蛋白的磷酸化進而抑制NF-κB-p65入核，緩解脂多糖誘導的急性炎癥反應[15]。Franchin等[16]研究發現，蜂膠的正己烷和水溶性組分能夠通過調節和炎癥因子從而緩解機械性炎癥過敏。此外，從無刺蜂蜂膠中分離得到的香豆素類單體成分Cinnamoyloxy-mammeisin（CNM）能夠降低肽聚糖誘導的巨噬細胞炎癥反應中ERK-1/2、JNK、p38 MAPK和AP-1等蛋白的磷酸化，并且抑制NF-κB信號通路的激活從而減緩巨噬細胞的炎癥反應[17]。【本研究切入點】蜂膠具有抗氧化、NO清除能力、抗糖尿病和抑菌等生物學活性[6,10]，但與其抗炎和抗氧化相關的分子機制研究未見報道。【擬解決的關鍵問題】通過體外自由基清除能力評估蜂膠乙醇提取物（ethanol extract ofpropolis，EEHI）的抗氧化活性，分析EEHI對RAW 264.7小鼠巨噬細胞增殖活力及NO釋放量的影響，并測定EEHI對脂多糖誘導的細胞炎癥因子和抗氧化基因在mRNA轉錄水平表達的影響，通過進一步的免疫印跡和免疫熒光技術探究EEHI對NF-κB信號通路的影響。

1 材料與方法

試驗于2017年11月至2018年6月份在中國農業科學院蜜蜂研究所蜂產品研究室完成。

1.1 供試材料、試劑與儀器

蜂膠樣品于2017年10月采集于馬來西亞沙撈越州詩巫市常青蜂場，-20℃冰箱儲存。

CCK-8試劑盒（Dojindo，日本）；LPS（脂多糖）（Sigma-Aldrich，美國）；DMEM高糖培養基，FBS（Gibco Laboratories，美國）；青鏈霉素混合液（100×）（索萊寶生物科技有限公司，中國）；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、2,2’-聯氮-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸二銨鹽）自由基（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline- 6-sulphonate) radical，ABTS+·）（Sigma-Aldrich，美國）；PCR引物，Prime ScriptTMRT Master Mix試劑盒，TB Green ?Premix Ex TaqTM（生工生物（上海）股份有限公司），異硫氰酸胍，BSA（Sigma-Aldrich，美國）；特異性抗體：IkappaB-alpha（Iκ-Β）（Cell signaling technology，美國），phosphor-IkappaB-alpha（P-IκΒ）（Cell signaling technology，美國），-actin購自Abcam公司（Cambridge，美國）；NF-κB-p65（Cell signaling technology，美國）；BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色劑（碧云天，中國）；一抗稀釋液、二抗稀釋液（武漢賽博生物科技有限公司，中國）。

SpectraMax?i3酶標儀（美谷分子儀器有限公司，中國）；NanoDrop 2000超微量分光光度計（賽默飛世爾科技有限公司，美國）；PCR儀（東勝創新生物科技有限公司，中國）；熒光定量PCR儀（杭州博中科技有限公司，中國）；激光共聚焦掃描顯微鏡（Leica，德國）。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理 稱取25 g粉碎的蜂膠樣品，按物料比1﹕15加入100%無水乙醇，40℃超聲3 h，過夜靜置后取上清，重復3次。混合3次上清浸提液減壓旋蒸至恒重，-20℃儲存。

1.2.2 總酚酸和總黃酮含量的測定 EEHI中總酚酸的含量檢測采用福林酚法[18]。取一定濃度的EEHI樣品溶液150 μL于1.5 mL離心管中，同時加入等體積的福林酚試劑，振蕩混勻后室溫避光反應5 min，然后加入450 μL 2%（W/V）的碳酸鈉溶液，搖勻后室溫避光反應2 h，取200 μL的反應試劑加入96孔板中，設置2個副孔，同時設置樣品空白對照，于=765 nm處測吸光值。以沒食子酸當量（gallic acid equivalent，GAE）為標準，計算EEHI中總酚酸的含量。

EEHI中總黃酮的含量的測定采用硝酸鋁法[18]。取一定濃度的EEHI樣品溶液300 μL于1.5 mL離心管中，同時加入硝酸鋁（100 g·L-1）溶液和醋酸鉀（9.8 g·L-1）溶液各20 μL，振蕩混勻后加入660 μL的蒸餾水，搖勻后室溫避光，靜置反應1 h后，取200 μL加入96孔板中，設置2個副孔，同時設置樣品空白對照，于=415 nm 處測吸光值。以槲皮素（quercetin equivalent，QE）為標準，計算EEHI中總黃酮的含量。

1.2.3 自由基清除能力測定 EEHI的ABTS+·自由基清除能力參考Yang等[18]方法并適當調整。于1.5 mL離心管中加入250 μL ABTS+·工作液和150 μL樣品，振蕩均勻后避光反應10 min。取150 μL反應液加入96孔板，于=734 nm波長處測定吸光度，記為A1，同時做樣品空白A2和試劑空白A0。每組樣品同時設置3個平行值。以試樣質量濃度和清除率計算線性回歸方程，并計算其半抑制濃度。EEHI樣品的ABTS+·自由基清除能力用IC50表示。計算公式：清除率（%）=[1-(A1-A0)/A2]×100。式中，A1為樣品上清液吸光值，A0為試劑空白組吸光值，A2為樣品空白組吸光值。

EEHI的DPPH自由基清除能力采用Yang等[18]方法并適當調整。于1.5 mL離心管中加入125 μL DDPH工作液和125 μL樣品，振蕩均勻后避光反應30 min。取100 μL反應液加入96孔板，于=517 nm波長處測定吸光度，記為A1，同時做樣品空白A2和試劑空白A0。每組樣品同時設置3個平行值。以試樣質量濃度和清除率計算其線性回歸方程，并計算其半抑制濃度。EEHI樣品的DDPH自由基清除能力用IC50表示，清除率計算公式同上。

1.2.4 抗炎活性測定 細胞培養及細胞活力測定：RAW 264.7小鼠巨噬細胞系由浙江大學胡福良教授惠贈。用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液（100×）的DMEM高糖培養基培養小鼠巨噬細胞RAW 264.7，37℃、5% CO2培養箱孵育，1 d傳代一次。將1.5×105個/mL小鼠巨噬細胞RAW 264.7均勻接種于96孔板中，待細胞長到70% 左右，加入不同濃度的EEHI。處理24 h后，每孔加入10 μL CCK-8反應2 h后，于=450 nm處檢測吸光值，以樣品空白組為對照計算細胞相對存活率。

Griess法測定樣品對細胞中NO含量的影響：將1.5×105個/mL小鼠巨噬細胞RAW 264.7均勻接種于24孔板中，待細胞長到70%左右，加入不同濃度的EEHI孵育1 h后，加入終濃度為1 μg·mL-1脂多糖誘導細胞炎癥反應，繼續孵育24 h。收集細胞培養液，5 000 r/min離心10 min，取上清，與等體積Griess A試劑混合均勻后，取100 μL反應液于96孔板中并加入50 μL Griess B，避免氣泡產生，搖勻，于=540 nm處檢測吸光值。根據NO2-標準曲線計算NO的含量。

樣品對細胞中相關炎癥因子在mRNA水平表達影響的檢測：將1.5×105個/mL RAW 264.7細胞均勻接種于24孔板中，待細胞長到70%左右，加入不同濃度的EEHI孵育1 h，而后加入終濃度為1 μg·mL-1脂多糖，孵育6 h。采用CarryHelix RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，采用NanoDrop 2000超微量分光光度計測所提取樣品RNA 的濃度和純度，使用PrimeScriptTMRT Master Mix反轉錄試劑盒，以1000 ng總RNA反轉錄合成cDNA模板，反轉錄產物置于-20℃待用。實時熒光定量PCR采用TB Green ?Premix Ex TaqTM試劑盒進行，引物序列如表1所示。反應體系（總體積10 μL）：TB Green ?Premix Ex TaqTM5.0 μL，上游引物0.2 μL，下游引物0.2 μL，cDNA模板0.2 μL，RNase Free dH2O 4.4 μL。

表1 實時熒光定量PCR相關引物序列

免疫印跡（Western blot）：將1.5×105個/mL RAW 264.7細胞均勻接種于6孔板中，待細胞生長至90%融合度，經不同濃度的EEHI孵育1 h，加入終濃度為1 μg·mL-1的脂多糖，于37℃，5% CO2培養箱孵育0.5 h后，用含酶抑制劑的NP-40蛋白裂解液收集提取蛋白樣品，然后采用BCA測定樣品蛋白濃度，按照20 μg的蛋白總上樣量對各組細胞樣本蛋白進行免疫印跡檢測，經過12%的SDS-PAGE凝膠電泳、轉印、雜交、堿性磷酸酶顯色等步驟，得到IκΒ、p-IκΒ和-actin的雜交條帶。

NF-κB-p65的免疫熒光定位：將處于對數生長期的細胞按9×104個/mL接種到爬片共聚焦小皿中，37℃，5% CO2培養箱過夜孵育，預處理40 μg·mL-1的EEHI 1 h，加入終濃度為1 μg·mL-1的脂多糖0.5 h后，用固定液（甲醇﹕丙酮=1﹕1）固定0.5 h，0.5%的Triton X-100透化0.5 h，10%血清封閉液室溫封閉0.5 h，加入1﹕50的一抗（NF-κB-p65）稀釋液和1﹕500的二抗羊抗兔（IgG）稀釋液分別孵育1 h，DAPI（1﹕2 000稀釋）染核處理封片，激光共聚焦掃描顯微鏡觀察，并分析結果。

1.3 數據處理與分析

試驗結果均以平均值±標準差（mean±SD）表示，數據采用SPSS軟件進行ANOVA分析，Graphpad Prism 5.0作圖。＜0.05表示差異顯著，＜0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 總酚酸和總黃酮的含量及體外自由基清除能力

由表2可知，EEHI的總酚酸含量為54.70 mg GAE·g-1，總黃酮含量為116.20 mg QE·g-1。EEHI抑制50% DPPH和ABTS+·自由基的濃度分別為275.60和284.00 μg·mL-1。

表2 EEHI總酚酸和總黃酮的含量及體外自由基清除能力

2.2 EEHI對巨噬細胞RAW 264.7細胞活力的影響

為保證EEHI對細胞的代謝生長無明顯的毒性，采用CCK-8法檢測0—50 μg·mL-1的EEHI對小鼠巨噬細胞 RAW 264.7細胞相對增殖活力的影響，結果如圖1所示。與對照組相比，RAW 264.7細胞經過不同濃度EEHI處理后，0—40 μg·mL-1的EEHI對細胞生長無顯著抑制效果，而50 μg·mL-1的EEHI對細胞的生長有顯著的抑制作用。因此，40 μg·mL-1為EEHI的安全濃度上限。

2.3 EEHI對小鼠巨噬細胞RAW 264.7中NO釋放量的影響

通過典型的Greiss法檢測不同濃度EEHI對脂多糖誘導的巨噬細胞炎癥反應模型中NO釋放量降低的效果。如圖2所示，RAW 264.7細胞單獨經過脂多糖刺激后，NO含量相對于對照組明顯升高。在經過EEHI孵育后再加入脂多糖刺激與脂多糖組相比，NO釋放量呈極顯著下降趨勢，且具有濃度依賴性。因此，EEHI能夠抑制炎癥過程中NO含量的產生，從而緩解炎癥反應。

**：P＜0.01

***：P＜0.001

2.4 EEHI對巨噬細胞 RAW 264.7炎癥相關因子表達的影響

RT-qPCR結果表明，EEHI能夠極顯著地抑制脂多糖誘導的、和等基因的表達，其中EEHI對、表達的抑制作用與濃度相關。此外，EEHI在10 μg·mL-1時能夠顯著促進表達，在20—50 μg·mL-1時能極顯著增加表達（圖3）。因此，在安全濃度范圍以內，EEHI具有良好的抗氧化和抗炎能力。

A：誘導型一氧化氮合酶INOS；B：白介素-10 IL-10；C：白介素-1β IL-1β；D：血紅素氧合酶1 HO-1。*：P＜0.05；***：P＜0.001

2.5 EEHI對脂多糖誘導的IκΒα活化的抑制作用

采用Western blot方法檢測細菌脂多糖誘導的巨噬細胞中IκΒ和磷酸化IκΒ的蛋白相對表達水平，結果發現脂多糖刺激組IκΒ的磷酸化明顯增加，而經過不同濃度EEHI孵育后處理組IκΒ的磷酸化水平被抑制，且隨著EEHI濃度的增加，p-IκΒ顯著降低（圖4）。

2.6 EEHI對巨噬細胞p65(NF-κB)核定位的影響

為進一步探究EEHI對NF-κB激活的抑制作用，采用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察40 μg·mL-1的EEHI對脂多糖誘導的炎癥信號通路NF-κB-p65入核定位的影響，結果表明脂多糖刺激組顯著激活了NF-κB-p65入核，而經過40 μg·mL-1的EEHI預處理后，NF-κB-p65入核受到了明顯的抑制（圖5）。

圖4 不同濃度EEHI對細菌脂多糖誘導的IκBα活化的抑制作用

圖5 EEHI對NF-κB-p65激活的影響

3 討論

無刺蜂蜂膠是由無刺蜂采集的用來維持蜂群健康、防止病敵害的樹脂混合無刺蜂分泌物以及泥土的一種天然特色蜂產品。國內的研究主要集中在意大利蜜蜂采集的蜂膠，由于地理和環境優勢，國外對無刺蜂蜂產品研究較多，但關于無刺蜂蜂膠的藥理學活性研究目前尚不全面。本研究采用的蜂膠采自馬來西亞本土無刺蜂蜂種，是典型的無刺蜂蜂膠，具有一定的代表性和研究價值。

酚酸類化合物被報道具有抗氧化、抑菌、消炎、抗過敏和抑菌等生物學活性。同時，一些黃酮類化合物被報道具有抗炎、抗氧化、抗癌、保肝、腸道保護作用[19-20]。越來越多的研究結果證明，蜂膠的體外抗氧化能力與其含有豐富的總酚酸和總黃酮息息相關[21]。蜂膠的DPPH和ABTS+·自由基清除能力是評估蜂膠體外抗氧化水平的兩種方法，且這兩種方法具備重現性、穩定性良好的特點。蜂膠中的總酚酸、總黃酮含量是評估蜂膠質量的重要指標。通過檢測蜂膠的總酚酸和總黃酮含量，筆者發現EEHI的總酚酸含量與文獻報道結果一致，且比和蜂膠中的總酚酸含量高（分別為47.78和29.10 μg·mL-1）。總黃酮含量高于蜂膠（61.5 μg·mL-1）[4]，卻低于文獻[7]報道的163.9 μg·mL-1，推測可能是由于樣品采集地點[4,22]和所采用的總黃酮當量的標準品[23-24]不同而造成。通過DPPH和ABTS+·自由基清除能力試驗發現，該蜂膠雖然富含相對于蜂膠高的酚酸和黃酮，但是自由基清除能力卻與文獻報道存在明顯差異，由此證明雖然多酚類化合物對蜂膠抗氧化能力起主要作用，但不一定高含量的酚酸和黃酮類化合物就具有最高的抗氧化能力，也可能與EEHI中酚酸黃酮類化合物的分子結構基團有關[3,25]。

炎癥發生時會產生超氧自由基、過氧亞硝酸鹽、過氧化氫、次氯酸和NO等高活性物質。NO是一種具有血管舒張、神經傳導和炎癥反應生物功能的小分子。巨噬細胞在脂多糖刺激下會促進催化精氨酸產生NO和促炎細胞因子，而在巨噬細胞中NO的過量產生會導致一系列的生理反應，如炎癥、細胞毒性和自身免疫失調[26]，所以天然毒副作用小的NO抑制劑對緩解炎癥反應是一個很好的選擇。（誘導型一氧化氮合酶）作為一氧化氮合酶之一，是炎癥條件下表達的關鍵酶，能夠通過脂多糖誘導產生高水平含量的NO，從而影響細胞的氧化還原狀態并誘導蛋白質、脂類和DNA的氧化，加速炎癥反應的發生[27]；（白介素-1）是一種細胞促炎因子，在釋放前列腺素中扮演著重要的角色，并且與中性粒細胞在炎癥反應中的遷移直接相關[16]；（白介素-10）是一種具有釋放免疫介質、呈遞抗原、抑制單核巨噬細胞釋放炎癥因子等多功能的細胞因子；（血紅素氧合酶1）能被過氧化氫、紫外線、NO等多種引起氧化應激的反應誘導，催化血紅素降解產生一系列具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等分子[28]。通過Griess和RT-qPCR方法研究發現，EEHI能夠極顯著抑制脂多糖誘導的巨噬細胞的NO釋放量，并抑制的表達，與前人報道一致[11]，EEHI能夠依賴濃度關系清除NO含量，在采用脂多糖誘導的小鼠巨噬細胞Raw 264.7細胞炎癥反應模型中，EEHI具有與中國蜂膠和巴西綠膠相近的NO清除能力[16]。此外，相對于脂多糖刺激組，EEHI極顯著抑制了細胞炎癥因子基因、的表達量，并顯著上調細胞中抗氧化蛋白基因的表達，表明EEHI能夠通過降低細胞中炎癥介質的表達，增強對其氧化應激的保護作用，從而減緩巨噬細胞的炎癥反應，與文獻報道相一致[10]，EEHI具有NO清除能力，且與意大利蜜蜂蜂膠（主要是中國楊樹型蜂膠、巴西酒神菊屬型蜂膠）及巴西無刺蜂蜂膠相同，能夠通過調節炎癥介質的表達緩解炎癥反應的發生，如、、、等。值得注意的是，EEHI與中國楊樹型蜂膠對抗炎癥因子的調節作用相同，均抑制的表達，但與巴西酒神菊屬型蜂膠的調節作用不一致，巴西酒神菊屬型蜂膠在低濃度時促進炎癥因子的表達，高濃度時表現出抑制作用[14-15,29]。

IκΒ是一種抑制NF-kB活性的抑制蛋白，正常情況下，NF-kB抑制蛋白IκΒ與P65/P50異二聚體在細胞質中相互作用從而掩蓋NF-kB家族中的核定位序列。在脂多糖刺激下，IκΒ迅速磷酸化后被蛋白酶降解，導致游離的NF-kB自由進入細胞核[30]。NF-κB是具有激活轉錄基因功能的一組蛋白質，參與調節許多與免疫和炎癥相關的基因。細胞正常狀態時，NF-κB-IκΒs處于動態平衡，在受到外界刺激下，IκΒs被降解蛋白酶降解后，NF-κB家族中的核定位序列與IκΒs相互作用并攜帶定位信號，使被激活的NF-κB由細胞質迅速向細胞核移動。NF-κB-p65被激活后暴露出核定位位點，快速轉移到細胞核中并大量分泌炎癥因子，對機體產生傷害[31]。通過Western blot和免疫熒光進一步探究EEHI緩解脂多糖誘導的巨噬細胞炎癥反應的作用機制，發現EEHI能夠顯著抑制IκΒ的磷酸化和炎癥信號通路NF-κB-p65的激活，由此推測EEHI與中國楊樹型蜂膠[15]、巴西無刺蜂蜂膠中的CNM[17]在NF-κB信號通路作用機理上可能存在一致性，主要是通過降低IκΒ的磷酸化并抑制NF-κB-p65的激活從而抑制NF-κB的激活，緩解炎癥因子在細胞核內的分泌和轉錄，從而緩解炎癥反應。

近年來，大量的研究證明植物以及蜂膠中的酚酸、黃酮具有良好的抗炎及抗氧化效果，包括山奈酚、阿替匹林-C、倒捻子素等。黃酮類化合物不僅具有清除巨噬細胞中NO的含量和降低表達的效果，更能夠通過調節NF-κB以及多種蛋白信號通路緩解機體炎癥的發生[13]。同時，植物中的萜烯類化合物具有潛在的自由基清除能力，并能夠降低細胞中NO含量以及炎癥相關因子（、）的表達，同時抑制NF-κB的活性[32]。由此，筆者推測EEHI的抗炎和抗氧化活性，不僅與其豐富的多酚類化合物密切相關，豐富的萜烯類化合物也可能為良好的抗氧化和抗炎活性提供了一定的輔助作用，而關于萜烯類化合物的活性效果需要進一步驗證。

4 結論

無刺蜂蜂膠含有豐富的多酚類化合物，且具有良好的體外自由基清除能力。在細菌脂多糖誘導小鼠巨噬細胞炎癥反應試驗中，蜂膠乙醇提取物（EEHI）顯著抑制了細胞炎癥因子、的表達，上調細胞中抗氧化基因的表達，并通過降低細胞中的表達從而抑制細胞中NO的釋放；另外，EEHI可通過抑制IκΒ蛋白的磷酸化和NF-κB-p65的激活從而抑制NF-κB轉錄因子的活性，緩解炎癥反應。研究結果可為無刺蜂相關特色蜂產品開發提供理論依據。

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Antioxidative and Anti-inflammatory Activities of Ethanol Extract of Geopropolis from Stingless Bees

WANG Bei1,2, CHANG Huasong2, SU Songkun1, SUN Liping2, WANG Kai2

(1College of Bee Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002;2Institute of Apicultural Research, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100093)

【Objective】Stingless bees are one of the important pollinators in tropic and subtropical area, differ fromwith typical stingless characteristic. Stingless bee collected more propolis thanthat of. Nevertheless, the study on the geopropolis activity was relatively scarce. The objective of this study is to evaluate theantioxidant and anti-inflammatory activities of the ethanol extract of geopropolis collected from stingless bee,, which is an indigenous stingless bee species in Malaysia. 【Method】The content of total phenolic acid and total flavonoids in the EEHI (ethanol extract ofpropolis) was determined by Folin-phenol method and AlNO3colorimetry, respectively. The antioxidant activity was investigated using DPPH and ABTS＋·free radical scavenging assays. Moreover, the inflammatory model of murine macrophage RAW 264.7 was induced by bacterial endotoxin lipopolysaccharide (LPS) and the effect of EEHI on the relative cell viability was detected via CCK-8 method. On the basis of ensuring that EEHI has no cytotoxic effect on cells, Griess method and RT-qPCR technique were applied to evaluate the effect of EEHI on the release of inflammatory mediator NO, and on the expression of inflammatory factors (,and) as well as antioxidant gene () in LPS-activated macrophages, respectively. In order to explore the potential anti-inflammatory mechanisms of EEHI, the effects of EEHI on the expression of p-IκBand IκΒin macrophages induced by LPS and the translocation of NF-κB-p65 protein were further studied by Western blot and immunofluorescence methods. 【Result】The content of total phenolic acid and total flavonoids in the EEHI was 54.70 mg GAE·g-1and 116.20 mg QE·g-1, and the IC50value of the EEHI for scavenging of DPPH and ABTS＋·free radicals was 275.60 and 284.00 μg·mL-1, respectively. The safe concentration of EEHI to RAW 264.7 cells was 0-40 μg·mL-1. In LPS-challenged macrophages, EEHI at 0-40 μg·mL-1significantly inhibited the release of NO as well as the expression of pro-inflammatory cytokine genes (,and), and enhanced the expression of antioxidant geneHO-1 in a dose-dependent manner, compared with the LPS-treated control. Furthermore, it was noticed that EEHI at 0-40 μg·mL significantly inhibited the LPS-stimulated phosphorylation of IκΒαprotein in a dose-dependent manner, and EEHI at 40 μg·mL-1significantly reduced the nuclear migration of NF-κB-p65 protein. It was suggested that EEHI had potential anti-inflammatory effects by inhibiting the activation of NF-κB inflammatory signaling pathway induced by LPS.【Conclusion】The ethanol extract of geopropolis collected fromcontains a large number of polyphenols, which has good antioxidant and anti-inflammatory effects, and is of great value for exploitation and utilization in the future.

stingless bee; geopropolis; antioxidant; anti-inflammatory; NF-κB

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.05.015

2018-09-28；

2018-11-30

國家自然科學基金青年科學基金（31702287）、國家蜂產業技術體系專項（CARS-44）、國際合作項目“常青蜂場蜂膠有效成分鑒定”

王蓓，E-mail：m13121180309@163.com。通信作者王凱，E-mail：kaiwang628@gmail.com

（責任編輯 岳梅）