MNNG誘導的胃癌前病變大鼠胃黏膜CTGF及ET-1表達的變化

俞建順 蔡丹莉 嚴茂祥 王小奇 桑怡 劉慶生*

作者單位：310021 杭州市丁橋醫院（俞建順）

310000 浙江省中醫院（蔡丹莉 嚴茂祥）

310007 杭州市中醫院（王小奇 桑怡 劉慶生）

胃癌是最常見的消化道腫瘤之一，嚴重威脅人類的生命健康。其發病率在全球高居男性腫瘤第4位，病死率排在第3位［1-2］。慢性萎縮性胃炎伴有腸上皮化生（Intestinalmetaplasia，IM）和異型增生（Dyspldsia，Dys）的病理狀態稱為胃癌前病，是從正常胃黏膜發展至胃癌的重要階段。通過阻斷胃癌前病變的進展可顯著降低胃癌的發病率。因此，探索胃癌前病變的發生機制，具有重要的臨床意義。研究發現，在胃癌前病變向胃癌的發展過程中，血管形成的程度逐漸加重，血管生成在胃癌發生的早期即已啟動［3］。本文研究與血管生成密切相關的結締組織生長因子（Connective tissue growth factor，CTGF）和內皮素 -1（Endothelin-1，ET-1）在胃癌前病變組織中表達的變化，探索其發病機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年SPF級SD大鼠36只，4～5周齡，雌雄比例2∶1，來自上海斯萊克實驗動物有限公司。適應性喂養4周后至大鼠2+月齡，以2∶1配種，雌性大鼠懷孕后與雄性分開喂養，自由飲水和撮食，選擇出生3d乳鼠進行實驗。

1.2 主要試劑 1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍（MNNG，Lot：ZZRRL-OR）購自東京化成工業株式會社，總RNA提取試劑盒（Lot：AK401）和RT試劑盒（Lot：AK3501）購自大連TaKaRa公司，CHamQTM SYBRR qPCR Master Mix（Lot：AK7803）購自南京諾唯贊生物科技有限公司，CTGF（B-6）鼠單克隆抗體（Lot：C0916）和 ET-1/2/3（H-38）鼠多克隆抗體（Lot：J1811）購自美國Santa Cruz公司，GAPDH鼠單克隆抗體（Lot：6153702）、Goat anti-mouse IgG（H+L）（Lot：5223340）購自杭州聯科生物技術有限公司。總蛋白提取試劑盒（Lot：20160318）購自江蘇凱基生物技術股份有限公司。引物由生工生物工程（上海）有限公司設計合成，CTGF上游引物5'-GAG TCG TCT CTG CAT GGT CA-3'，下游引物5'-GCA GCC AGA AAG CTC AAA CT-3'，擴增片段121bp，ET-1 上游引物5'-CTG GAC ATC ATC TGG GTC AA-3'，下游引物5'-CTG TTC CCT TGG TCT GTG GT-3'，擴增片段122bp；β-actin上游引物5'-TGT TGC CCT AGA CTT CGA GCA-3'，下游引物5'-CCA TAC CCA GGA AGG AAG GCT-3'，擴增片段155bp。

1.3 動物分組及處理 3d齡乳鼠共72只隨機分為正常組和模型組，每組各36只，雌雄各半。乳鼠與母鼠同養，母乳喂養，模型組乳鼠每天禁食2h后以0.1ml MNNG（800mg/L）灌胃，正常組灌服等量生理鹽水，連續10d。所有實驗大鼠均3周齡斷乳并分籠后采用全價顆粒飼料喂養，自由采食飲水。從MNNG灌胃結束后次日起計時，于實驗第4周、16周、28周末禁食過夜后麻醉下每組分別處死大鼠12只，雌雄各半，取胃組織，沿大彎側剖開，生理鹽水沖洗，取胃竇至胃體小彎側長條組織固定在10%中性福爾馬林溶液中固定，剩余組織存入-75℃待用。

1.4 檢測方法 大鼠胃黏膜組織病理學變化使用常規HE染色檢測，診斷參考中國慢性胃炎共識（2012年，上海）和異型增生病變Pavoda國際分級標準。qRTPCR法檢測雄性大鼠胃黏膜組織CTGF、ET-1 mRNA的表達：將大鼠胃黏膜內提取的總RNA通過反轉錄獲得cDNA，隨后進行PCR反應，結果以β-actin為內參，2-△△Ct表示各基因的相對表達量。Western blot檢測雄性大鼠胃黏膜組織CTGF、ET1/2/3蛋白表達：胃黏膜蛋白通過電泳、轉膜、一抗孵育（CTGF：1∶100；ET-1/2/3∶1∶200）、二抗孵育等步驟后化學發光檢測，目標蛋白/GAPDH灰度值的比值即為各個蛋白的相對表達量。

1.5 統計學方法 采用SPSS 21.0統計軟件包。計量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析；計數資料采用非參數秩和檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌前病變形成過程中胃黏膜病理變化 HE染色光鏡觀察發現，不同時相點的正常組大鼠胃黏膜上皮細胞較完整，腺體排列規則而整齊，細胞核位于基底部呈橢圓形，可見少量淋巴細胞及漿細胞的浸潤，有部分大鼠腺體數量輕度減少。造模組大鼠胃黏膜可見淋巴細胞和漿細胞的浸潤，隨造模時間增加而程度加重，但未見明顯中性粒細胞浸潤，模型組16周雄性大鼠、28周組胃黏膜慢性炎癥程度較同期正常組明顯增高（P＜0.05、P＜0.01）；造模組4周和16周時分別有1例和2例雄性大鼠胃黏膜固有腺體輕度萎縮，28周時所有大鼠出現不同程度萎縮，較同期正常組增高（P＜0.05）。模型組4周時大鼠腺體結構排列尚規則，16周時雄性大鼠2例出現非確定不典型增生，28周時腺體結構排列紊亂加重，大鼠出現不同程度不典型增生，以雄性較雌性明顯，各大鼠均未見腸上皮化生，模型組28周胃黏膜典型增生程度較同期正常組明顯增加（P＜0.05、P＜0.01）。見圖 1。

圖1 大鼠胃黏膜病理學變化（HE染色×100；A：正常組，B：模型4周組，C：模型16周組，D：模型28周組）

2.2 雄性大鼠胃黏膜CTGF及ET-1 mRNA表達的變化 在4周、16周和28周三個時相點，模型組雄性大鼠胃黏膜內CTGF及ET-1 mRNA的表達均較正常組有升高趨勢。見圖2。

圖2 雄性大鼠胃黏膜CTGF、ET1mRNA表達的變化（x±s）

圖3 雄性大鼠胃黏膜CTGF、ET-1/2/3蛋白表達的變化（s）；與正常組比較，?P＜0.05，#P＜0.01

圖4 雄性大鼠胃黏膜CTGF、ET-1/2/3蛋白表達條帶圖

2.3 雄性大鼠胃黏膜CTGF及ET-1/2/3蛋白表達的變化 模型組雄性大鼠4周時胃黏膜CTGF蛋白表達較正常組顯著降低，而在16周及28周較正常組升高，其中28周差異有統計學意義（P＜0.01）。在胃黏膜內ET-1/2/3蛋白的表達上，模型組雄性大鼠在4周和28周均較正常組大鼠升高，其中28周差異有統計學意義（P＜0.01），而在16周則較正常組有降低趨勢。見圖3、4。

3 討論

血管生成是正常組織生長和分化過程中的基本過程，并且在多種人類疾病中扮演著關鍵的角色。過度的血管生成見于牛皮癬、關節炎、糖尿病視網膜病變和惡性腫瘤等疾病中。腫瘤相關的血管生成目前被認為是一種重要的治療靶點。然而，關于血管生成和癌前病變之間聯系的研究較少。關于血管生成和癌前病變之間存在聯系最初的證據來源于對微血管密度（MVD）的研究。MVD被發現在鱗狀細胞癌前病變中大范圍增加，如口腔黏膜、皮膚、子宮頸、外陰和肛管中［4］。Tuccillo等［5］發現，幽門螺桿菌相關胃炎內存在血管內皮生長因子（VEGF）表達的增加，這一增加和胃黏膜內血管的形成的增加相關。而VEGF表達的增加同樣存在于腸上皮化生和異型增生的胃黏膜腺體中，提示胃癌前病變同樣存在血管生成的增加。

CTGF首先是作為血小板來源的生長因子相關絲裂原（人血管內皮細胞分泌）被發現的，一般由內皮細胞、成纖維細胞平滑肌細胞和成肌纖維細胞表達，一些上皮細胞也可表達［6］。CTGF和多種調節過程有關，如血管再生、軟骨形成、骨發生、纖維化形成、糖尿病腎病和腫瘤形成等［7］。在不同的腫瘤組織中，其表達和腫瘤組織的生長和抑制均有關。在乳腺癌、胰腺癌、胃癌等腫瘤組織中，CTGF的表達和腫瘤的進展呈正相關，而在卵巢癌、結腸癌、軟骨肉瘤、肺癌等腫瘤組織中則呈負相關。在胃癌患者體內，其表達和淋巴結轉移、腹膜轉移的程度呈正相關，而和生存時間呈負相關。CTGF參與癌細胞的浸潤與轉移、遷移、血管生成和失巢凋亡等過程。在低氧環境下，CTGF被激活并釋放，通過調控VEGF誘導的血管生成，在腫瘤的形成與發展中起到了重要的作用。

ET是一種由21個氨基酸組成的內源性肽，包括ET-1、ET-2和ET-3三種亞型，是迄今為止最有效的血管收縮劑，并且和細胞增殖、遷移，血管生成和細胞凋亡有密切關系。ET-1是研究最為廣泛的內皮素，是人類心血管系統內最豐富的類型。ET-1主要來源于血管內皮細胞，但也可由其他細胞生成，如肺、腎臟和結腸等器官的上皮細胞，巨噬細胞和單核細胞，周圍腸神經膠質細胞和中樞神經系統的脈絡叢和某些神經元以及反應性神經膠質細胞［8］。ET-1的表達在多種腫瘤中均有增加，包括肺、前列腺、結直腸、肝臟、乳腺和卵巢癌，這可能和其對細胞生長、轉移和血管生成的促進作用和細胞凋亡的抑制作用有關。研究證明，低氧能夠刺激內皮細胞合成ET-1［8-9］，而ET-1參與的血管生成在腫瘤的發生與發展中起到了重要作用。

本研究發現，胃癌前病變大鼠胃黏膜組織存在胃黏膜內皮細胞的損傷，血流減少導致局部的缺血、瘀血和水腫等，說明胃組織受損及繼發炎癥時，均伴隨缺氧現象。隨著造模時間的延長，大鼠逐漸出現胃癌前病變，胃黏膜內CTGF及ET mRNA的表達呈現逐漸上升的趨勢，而盡管模型組大鼠在4周時CTGF蛋白的表達較正常組減少，在16周時ET-1/2/3蛋白的表達較正常組有減少趨勢，但在造模28周時兩者均較正常組顯著升高。說明MNNG誘導的大鼠胃癌前病變的發生與發展伴隨著CTGF和ET-1的表達的增加。造模早期兩者的下降可能和機體的自我保護機制有關：通過減少兩者的表達抵抗血管的發生，從而防止胃癌前病變的發生。

綜上所述，低氧環境可誘導CTGF和ET-1的激活，從而促進血管的生成，這可能是胃癌前病變的發生和發展的機制之一，可為防止胃癌前病變提供新的思路。