ANIT誘導的亞急性肝內膽汁淤積大鼠腸道菌群結構的變化

姚嘉明 陳芝蕓 陳曦 劉彬彬 葉蔚 張潔

作者單位：310007 杭州市中醫院（姚嘉明 劉彬彬 葉蔚 張潔）

310006 浙江省中醫院（陳芝蕓）

641000 四川省內江市第一人民醫院（陳曦）

肝內膽汁淤積是一種臨床常見病，指因各種原因導致膽汁的形成、分泌和（或）排泄出現異常，出現肝內膽汁酸和其他有毒化合物積累引起肝損傷的病理狀態。該病發生原因復雜，常見病因主要有病毒、細菌、寄生蟲、藥物和/或毒物、自身免疫、雌激素、酒精、全胃腸外營養、腫瘤和遺傳代謝等。膽汁淤積與腸道微生態破壞可互為因果，探索肝內膽汁淤積發病時腸道菌群的變化對該病的防治具有重要意義。作者自2015年1月至2018年9月使用ANIT間歇性多次給藥成功建立了亞急性肝內膽汁淤積大鼠模型，并取新鮮糞便進行16s rRNA高通量測序觀察其腸道菌群結構變化情況，旨在為該病的腸道微生態動物實驗研究提供必要的實驗數據及理論依據。

1 材料及方法

1.1 實驗動物 SD大鼠16只，雄性，清潔級，體重190～210g，由上海市西普-必凱實驗動物有限公司提供，許可證號SCXK（滬）2013-0016。

1.2 主要試劑 異硫氰酸萘酯（ANIT）由上海百靈威化學技術有限公司提供。

1.3 分組及處理 16只SD大鼠隨機分成正常組和模型組，每組各8只。模型組于實驗第1天灌服1.6%濃度的異硫氰酸萘酯（麻油配制）80mg/kg，1次/周，連續4次，末次灌胃后48h處理大鼠；正常組以等容量的麻油灌胃代替；所有大鼠予以標準大鼠飼料喂養，自由飲水。各大鼠于處理前16h禁食不禁水，空腹麻醉下取血，分離血清待用；于大鼠腹部去毛局部消毒，剖腹無菌取回盲部新鮮腸內容物放入滅菌EP 管，液氮凍存后送檢進行16s rDNA測序分析。

1.4 檢測方法 采用全自動生化儀檢測血清丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、谷氨酰轉肽酶（GGT）、總膽汁酸（TBA）、總膽紅素（TBIL）水平。采用磁珠法提取大鼠腸內容物DNA，16s rRNA基因測序方法進行腸道菌群檢測，由杭州谷禾信息技術公司采用Illumina MiSeq測序儀完成，平均每個樣本的clean reads≥10萬條，使用高可變區的PCR擴增產物建庫，用QIIME軟件進行菌群豐度、多樣性及組成等分析。

1.5 統計學方法 采用IBM SPSS Statistics 19.0軟件包。計量資料符合或近似符合正態分布數據，以（±s）表示，采用獨立樣本t檢驗進行兩組間比較；不符合正態分布數據采用中位數和四分位數間距表示，采用Mann-Whitney U檢驗進行兩組間比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 亞急性肝內膽汁淤積大鼠血清肝功能水平的變化 見表1。

注：與正常組比較，*P＜0.01

2.2 亞急性肝內膽汁淤積大鼠糞便16s rRNA高通量測序分析 （1）測序概況：總共測得了704424個樣本序列，其中578567個序列獲得了OTUs（operational taxonomic units）注釋。分析結果顯示，模型組測得的樣本序列數目、OTU數目、注釋上OTU的序列數目較正常組均明顯減少（見表2，P＜0.01），提示模型組大鼠腸道菌群豐度較正常組降低。（2）各組樣本Alpha多樣性分析：Alpha 多樣性反映的是單個樣本內部的物種多樣性，包括ACE指數、chaol指數、coverage、shannon 指數和Simpson 指數等。本研究對各組樣本的alpha多樣性進行計算，并繪制出相應Shannon-Winner曲線。①各組菌群豐度評估：通過ACE指數和Chao1指數評估兩組樣本的菌群豐度。結果顯示，ANIT灌胃后大鼠腸道菌群豐度明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。②各組菌群多樣性分析：通過shannon指數和Simpson指數評估各組樣品菌群多樣性。結果顯示，兩組大鼠腸道菌群多樣性未見顯著性差異（P＞0.05）。見表3。③樣品文庫覆蓋率評估：為衡量樣本取樣深度，進行Coverage指數和Shannon-Winner曲線分析。各組樣本Coverage 指數均趨近于96 %（見表2），提示測序深度已經基本能夠覆蓋該微生物群落中絕大多數細菌。各樣本的Shannon-Winner曲線趨于平坦，表明測序已趨于飽和，測序數據量足夠大，可以反映樣品中絕大多數的微生物物種信息，適合下一步的數據分析和研究。（3）各組大鼠腸道菌群門水平豐度分析：模型組大鼠糞便樣品中OTU總數較正常組明顯減少（見表4，P＜0.01），兩組樣本優勢菌門包括厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門。正常組覆蓋19個菌門，以擬桿菌門（Bacteroidetes）占比最高，其次分別為厚壁菌門（Firmicutes）及變形菌門（Proteobacteria），分別占51%、40%、6%，模型組覆蓋17個菌門，擬桿菌門（Bacteroidetes）比例較正常組有升高趨勢，其余兩門比例較正常組下降，但兩組間差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 5。

表2 樣本測序概況（±s）

表2 樣本測序概況（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.01

分組 n SampleSize OTUsNumber OTUsSeq Coverage模型組 8 37308.63±9185.27* 2342.75±334.76*29821.38±8445.769* 0.95±0.01正常組 8 50744.38±5743.58 3141.75±307.81 42499.50±5427.72 0.96±0.01

表3 各組樣本Alpha多樣性分析（中位數及四分位數間距）

表4 各組大鼠糞便各水平OTU數量（±s）

表4 各組大鼠糞便各水平OTU數量（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.01

分組 n 門 綱 科模型組 8 1792.88±243.32* 1792.88±243.32* 1581.88±222.29*正常組 8 2366.38±218.60 2366.38±218.60 2079.88±197.90

表5 各組大鼠糞便中菌群門水平相對豐度變化［%，（±s）］

表5 各組大鼠糞便中菌群門水平相對豐度變化［%，（±s）］

菌門 正常組 模型組Bacteroidetes 51.24±15.24 58.29±9.59 Firmicutes 40.53±12.43 36.11±8.86 Proteobacteria 6.71±3.66 4.42±1.25

2.3 各組大鼠腸道菌群綱水平豐度分析 正常組測得36個菌綱，模型組測得30個菌綱。兩組大鼠糞便樣品中綱水平占比居前10位分別為擬桿菌綱（Bacteroidia）、 梭 狀 芽 胞 桿 菌 綱（Clostridia）、δ-變 形 菌 綱（Deltaproteobacteria）、γ-變 形 菌綱（Gammaproteobacteria）、 芽 孢 桿 菌 綱（Bacilli）、β-變 形 菌 綱（Betaproteobacteria）、ε-變 形 菌綱（Epsilonproteobacteria）、4C0d-2、 產 芽 胞 菌 綱（Erysipelotrichi）、Coriobacteriia。見表 6。

表6 各組大鼠糞便中菌群綱水平相對豐度變化［%，（x±s）］

2.4 各組大鼠腸道菌群科水平豐度分析 正常組測得72個菌科，模型組測得70個菌科。各組大鼠糞便樣品中科水平占比居前12位分別為普雷沃菌科（Prevotellaceae）、疣微菌科（Ruminococcaceae）、S24-7、Paraprevotellaceae、 毛 螺 菌 科（Lachnospiraceae）、韋榮氏球菌科（Veillonellaceae）、脫硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）、 擬 桿 菌 科（Bacteroidaceae）、腸 桿 菌 科（Enterobacteriaceae）、 紫 單 胞 菌 科（Porphyromonadaceae）、乳桿菌科（Lactobacillaceae）、螺桿菌科（Helicobacteraceae）。見表7。

表7 各組大鼠糞便中菌群科水平相對豐度（%）變化（±s，n=8）

表7 各組大鼠糞便中菌群科水平相對豐度（%）變化（±s，n=8）

注：與正常組比較，*P＜0.05，#P＜0.01

菌科 正常組 模型組Prevotellaceae 17.30±9.96 23.66±12.80 Ruminococcaceae 15.60±3.48 18.15±5.23 S24-7 16.09±4.52 21.41±7.42［Paraprevotellaceae］ 15.99±10.20 12.55±6.19 Lachnospiraceae 10.81±9.02 6.47±3.13 Veillonellaceae 9.65±5.45 6.06±1.69 Desulfovibrionaceae 6.04±3.40 1.80±1.25*Bacteroidaceae 3.78±2.60 3.33±1.17 Enterobacteriaceae 0.36±0.35 1.01±1.04 Porphyromonadaceae 0.78±0.65 0.76±0.84 Lactobacillaceae 0.51±0.29 0.74±0.34 Helicobacteraceae 0.22±0.17 1.16±0.90*#

3 討論

ANIT是一種能造成膽汁淤積性肝炎的肝毒劑，被廣泛用于急性肝內膽汁淤積相關的實驗研究，動物一次性灌服該藥物后可出現與人類膽汁淤積性肝炎相似的血清生化學及肝組織病理學改變，48h達疾病高峰，后肝功能逐漸恢復，為一種自限性過程，項目組前期研究也證實了這種現象［1］。該法主要優勢為造模方便、成功率高。目前其具體作用機制仍未完全闡明。有研究表明，ANIT在體內可誘導肝細胞發生強烈的炎癥反應，中性粒細胞被活化，釋放大量的氧自由基［2］。ANIT所引起的脂質過氧化水平增加可能是導致膽汁淤積性肝炎病變發生的初始階段，而病理學改變則是其后續階段［3］。1998年，Marshall提出了“腸－肝軸”的概念，目前許多臨床研究也已證實膽汁淤積時腸道菌群與發病密切相關。肝內膽汁淤積發生后，由肝臟分泌的膽汁無法順利進入腸道，從而引起肝臟代謝功能紊亂，肝功能嚴重受損，腸道內缺乏膽汁酸鹽，無法清洗腸道，加上免疫系統受抑制、肝腸軸功能受損等一系列病理改變均可導致腸道菌群失調，造成腸道菌群和脂多糖（LPS）移位，而腸道菌群失調可進一步加重膽汁淤積，膽汁淤積與腸道菌群失調可互為因果［4］。有臨床研究發現膽汁淤積性肝病患兒大腸埃希菌數量較健康嬰兒升高，而雙歧桿菌、乳酸菌數量則低于健康嬰兒［5］。但在實驗研究方面，目前仍缺乏針對ANIT誘發的肝內膽汁淤積模型發病過程中腸道菌群變化的相關研究，這可能與該造模方法疾病高峰出現較早且為自限性，而許多腸道微生態研究需要一個亞急性或慢性發病模型相關。近年來歐巧群等［6］改良了上述模型，其使用ANIT間歇性多次減量灌胃成功建立了大鼠亞急性肝內膽汁淤積模型，其在用藥4周內均維持了明顯的肝內膽汁淤積，并出現了早期肝纖維化表現，這給ANIT法模型的腸道菌群研究創造了條件。本次研究參考以上經驗，在ANIT減量灌胃1次/周后，生化檢測提示23d內大鼠肝內膽汁淤積狀態穩定持續，表明該法確能較好地建立亞急性肝內膽汁淤積大鼠模型。本實驗16s rRNA高通量測序結果表明，ANIT干預后可使大鼠門、綱、科各水平腸道菌群的豐度明顯降低，但對菌群的多樣性影響相對較小，通過進一步對門、綱、科各水平的腸道菌群相對豐度分析顯示模型組及正常組差異主要是在變形菌門內部結構比例上：模型組腸道中δ-變形菌綱中的脫硫弧菌科比例較正常組明顯下降（P＜0.05），而ε-變形菌綱中的螺桿菌科比例較正常組則明顯升高（P＜0.01）。變形菌門雖然在健康人群腸道和糞便中所占的比例較低，但其包含了諸多的病原菌和機會致病菌，該分類下的細菌多為革蘭陰性桿菌，具有產生脂多糖的能力，膽汁淤積發生時，部分細菌在患者腸道中過度增殖可能導致腸黏膜炎癥并增加腸屏障功能障礙的風險，從而進一步阻礙膽汁酸的腸肝循環加重膽汁淤積，形成惡性循環。故作者推測，腸道菌群豐度的明顯下降以及腸道內變形菌門中脫硫弧菌和螺桿菌的相對豐度變化可能是ANIT誘發的大鼠肝內膽汁淤積的重要特征性變化。希望這一結果能為肝內膽汁淤積的腸道微生態動物實驗研究提供必要的實驗數據及理論依據，并有助于在今后開展進一步的深入研究。