四氫姜黃素對H22腹水瘤模型小鼠的防治作用

俞斐 章浙忠 陳琳 魯遙

作者單位：310000 浙江中醫藥大學附屬第一醫院

原發性肝癌（primary liver cancer，PLC）是臨床上最為常見的消化道惡性腫瘤之一，起病隱匿，病死率高，在腫瘤致死原因中位居第二位［1］。絕大數患者確診時已為中晚期，從而失去了外科手術治療的機會而采用化療，但不良反應較多［2］。姜黃素（CUR）自從被報道具有抗癌活性以來，廣泛受到國內外學者的關注。現代藥理研究表明，CUR可抑制癌細胞的生長，在腫瘤的治療方面，CUR的作用顯著。但由于其水溶性和穩定性差，在腸道易發生葡萄糖醛酸轉移酶介導的Ⅱ型代謝，口服后在體內代謝快，血藥濃度較低，生物利用度差，嚴重地限制了其臨床應用［3］。四氫姜黃素（THC）作為姜黃素的體內代謝產物，本實驗對THC進行抗腫瘤活性評價及其初步的機制探討，為更好的開發和利用姜黃素類化合物的藥用價值提供實驗依據和研究基礎。

1 材料與方法

1.1 動物及肝癌細胞株 健康雄性昆明KM小鼠90只，體質量（20±2）g，浙江中醫藥大學動物實驗中心提供；小鼠腹水型H22肝癌細胞株購于中國科學院上海細胞庫。

1.2 主要試劑與儀器 THC購于國藥集團化學試劑有限公司；環磷酰胺（CTX）購于上海國藥控股有限公司；冰醋酸、Tween-80購于廣東光華化學廠有限公司；蛋白定量試劑盒購于上海貝博生物科技有限公司。AR1140電子天平（美國奧豪斯公司）；SW-CJ-1F超凈工作臺（蘇凈集團安泰公司）；DHG-9023A電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）。

1.3 方法 （1）藥物劑量設計：本節實驗研宄中（除了用以初步探討作用機制的H22腹水瘤小鼠模型），雄性KM小鼠被隨機分成6組，每組各10只。所有小鼠在實驗前適應性飼養7d。正常組（Intact）和模型組（Vehicle）給予預防藥物的相應溶劑（0.5%Tween-80），預防給藥組小鼠給予低、中、高劑量的THC（5、10、20mg/kg）、環磷酰胺（CTX，30mg/kg），按0.1ml/10g體重給藥1次/d，連續給藥7d。（2）小鼠造模：將H22腹水瘤細胞凍存管從液氮罐中取出，置于37℃的溫水中使其融化，然后用吸管吸取適量細胞懸液至離心管內，加入10倍量無菌PBS緩沖液，混勻后于臺式離心機中離心5min（1000r/min），棄去上清液，收集H22細胞，重復清洗操作三次；之后用無菌PBS緩沖液調整為1×107/ml的細胞懸液，取100μl置于1ml EP管內，向其中加入等體積的0.4%臺盼藍染液，混勻后通過顯微鏡觀察，利用臺盼藍拒染法進行細胞計數，觀察H22細胞的存活率。經觀察后計算，細胞存活率＞96%。隨后向每只小鼠腹腔注射H22細胞懸液0.2ml復制H22腹水瘤小鼠模型（相當于瘤細胞數2×106/只），正常組除外。

1.4 H22腹水瘤模型小鼠生存周期實驗 小鼠腹水瘤造模成功24 h后，將KM小鼠隨機分為6組：空白對照組，模型對照組，陽性對照（CTX）組，THC低、中、高劑量組，每組各10只，除陽性對照（CTX）組腹腔注射（0.1ml/10g）給藥外，其余各組灌胃給藥1次/d，連續7d，每日觀察各組小鼠生活、飲食情況以及毛色等外觀狀況，統計各組小鼠的生存周期，比較各組之間的差異。

1.5 細胞計數分析儀檢測細胞活力與Western Blot檢測蛋白表達 鼠腹水瘤造模成功24h后，將KM小鼠隨機分為3組：模型對照組、陽性對照（CTX）組和THC（20mg/kg）組，每組各10只，除陽性對照（CTX）組腹腔注射給藥外，其余各組灌胃給藥，按0.1ml/10g體重給藥1次/d，連續給藥7d。每次灌胃前，測量統計各小組的體重。末次給藥1h后，脫頸處死各組小鼠，用無菌注射器抽取每只小鼠的腹水，取200μl用PBS緩沖鹽溶液處理后，立即檢測其細胞活力（全自動細胞計數分析儀），另外腹水收集后采用Western Blot檢測H22腹水瘤細胞中的Bax、Bcl-2的蛋白表達水平。取各組小鼠的胸腺和脾臟組織，精密稱重后記錄各組小鼠的免疫臟器重量。

1.6 統計學方法 采用SPSS22.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，各組間的差異比較采用方差分析（One-way ANOVA），實驗結果以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 THC對H22腹水瘤模型小鼠生存周期的影響 THC對H22腹水瘤小鼠生存周期的影響如圖1所示，在接種H22腹水瘤細胞4～5 d后，各組小鼠飲食和活動均開始減少，腹部開始出現膨脹，喜歡群居和蜷臥，體重也明顯增加。與模型組相比，THC（5、10、20mg/kg）給藥組能延長小鼠的生存周期，平均生存時間隨著給藥劑量的升高而提高，且與模型組差異顯著（THC低劑量組：P＜0.05，其余各組：P＜0.001），結果提示，THC能顯著延長小鼠的生存周期。因此，在后續實驗中，選取THC的高劑量組（20 mg/kg）對H22腹水瘤小鼠模型進行初步的機制探討。

圖1 THC對H22腹水瘤模型小鼠生存周期的影響（n=10，?P＜0.05，#P＜0.001）

2.2 THC對H22腹水瘤模型小鼠體重及腹水瘤細胞活力的影響 如圖2、3所示，給小鼠接種H22腹水瘤細胞后，小鼠的體重顯著上升，與模型組小鼠相比，THC在第5天后能明顯抑制小鼠的體重（5～7d，P＜0.001）；與模型組相比，THC治療后H22腹水瘤細胞活力顯著下降（P＜0.001），提示THC對小鼠惡性腹水有抑制作用。

圖2 THC對H22腹水瘤模型小鼠體重的影響

圖3 THC對H22腹水瘤細胞活力的影響（n=10，?P＜0.05，???P＜0.001）

2.3 THC對H22腹水瘤模型小鼠免疫器官的影響 THC對腹水瘤小鼠免疫臟器的影響如圖4所示，由圖可知與空白組小鼠相比，接種H22腹水瘤細胞后小鼠的免疫器官無明顯影響，而在給予THC干預后，小鼠的脾臟指數和胸腺指數也均無明顯變化，表明給予THC后對小鼠的免疫器官無明顯影響；相反，給予陽性藥CTX治療后，小鼠的脾臟指數（P＜0.001）和胸腺指數（P＜0.001）均顯著下降，表明陽性藥CTX可能對小鼠的免疫器官有毒副作用。

2.4 THC對H22腹水瘤模型小鼠Bax、Bcl-2蛋白表達水平的影響 THC對腹水瘤小鼠Bax、Bcl-2蛋白表達的影響如圖5所示，在分析統計各組小鼠條帶的灰度值后發現，THC給藥組與模型組小鼠相比能顯著提高Bax的蛋白表達（均P＜0.01）和抑制Bcl-2的蛋白表達含量（均P＜0.01），提示THC可能參與了Bcl-2介導的線粒體凋亡通路并能改善Bcl-2體系的蛋白表達。

圖4 THC對H22腹水瘤模型小鼠免疫器官的影響（n=10，?P＜0.001）

圖5 THC對H22腹水瘤模型小鼠Bax、Bcl-2蛋白表達水平的影響（n=3，?P＜0.01）

3 討論

在H22腹水瘤模型小鼠生存周期實驗中，THC能顯著延長小鼠的生存周期。而在后面對各組小鼠的體重、細胞活力和免疫器官指數進行統計分析的時候發現，THC能有效抑制腹水瘤小鼠體重，抑制小鼠腹水細胞的活力，與陽性藥CTX相比THC不影響小鼠體內的免疫器官，提示THC基本無毒副作用。因此在后續的實驗中，初步探究THC對H22腹水瘤模型小鼠的作用機制。

細胞的增殖和凋亡的動態平衡與腫瘤的發生發展密切相關。許多蛋白在細胞凋亡的發生和發展過程中發揮了重要的作用［4］。Bcl2家族蛋白是細胞內一組結構上同源功能上相關的蛋白。主要分為兩大類：一類是抑制細胞凋亡，如Bcl2、Bcl-xl等；另一類是促進細胞凋亡，如Bax、Bcl-xs等。其中Bcl2、Bax的表達為代表。Bcl2和Bax蛋白水平表達的高低，與細胞凋亡直接相關。Bax和Bcl-2通過形成同源或異源二聚體來調節細胞凋亡，當Bax形成同源二聚體時誘導細胞凋亡；Bax與Bcl-2形成異源二聚體時則實現了Bcl-2抑制細胞凋亡的功能。這與本實驗研究中發現THC給藥組與模型組小鼠相比能顯著提高Bax的蛋白表達（均P＜0.01）和抑制Bcl-2的蛋白表達含量（均P＜0.01）的結果類似。更多的臨床研究表明，多種不同類型的腫瘤均出現了Bax蛋白水平表達下降，Bcl2表達升高的現象，其兩者比例決定了細胞凋亡的走向。若Bcl-2/Bax比例增高，則抑制細胞凋亡，反之，則促進細胞凋亡［5］。

在本實驗H22腹水瘤模型小鼠的實驗研究中發現THC能提高腹水瘤小鼠的生活質量和生存周期，降低小鼠的體重和腹水量。進一步的機制研究表明THC能夠通過上調Bax蛋白水平，下調Bcl-2蛋白水平，提示THC可通過調節凋亡相關蛋白而抑制H22腹水瘤的生長，從而為四氫姜黃素的進一步研究提供理論基礎。