血清IL-8 CXCR1 CXCR2表達與2型糖尿病視網膜病變的相關性研究

肖巍 高建波 馬雅娟 陳林秀

作者單位：314000 浙江省榮軍醫院眼科

糖尿病視網膜病變是2型糖尿病患者較為常見的并發癥，其主要臨床表現為出血斑點、視網膜內微血管異常及黃斑水腫等導致患者視力下降甚至失明［1］。研究表明其發病機制與患者體內炎性反應、氧化應激反應密切相關［2］。2型糖尿病視網膜病變具有較高的發病率并嚴重影響患者的健康及生活質量，因而積極尋找與疾病相關的生物學指標對改善視網膜病變具有重要意義。研究表明IL-8與機體氧化應激反應有關，并可促使中性粒細胞、淋巴細胞等發生趨化反應而發揮其生物學效應［3］。IL-8與其CXCR1及CXCR2相互作用可參與腫瘤細胞增殖、新生血管形成及炎癥反應等病理過程。目前關于IL-8與CXCR1、CXCR2在2型糖尿病視網膜病變中的研究相對較少，因此本研究主要探討血清IL-8、CXCR1、CXCR2表達與2型糖尿病視網膜病變的相關性，為臨床早期診斷及治療糖尿病視網膜病變提供一定理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2015年1月至2016年5月于本院診治的2型糖尿病視網膜病變患者61例為研究組，另選取同期于本院進行體檢的健康人員55例為對照組。研究組中男37例，女24例；年齡45～76歲，平均（60.12±10.23）歲，糖尿病病程8～17月，平均（12.15±2.02）月。對照組中男31例，女24例；年齡43～78歲，平均（60.51±10.03）歲。根據視網膜病變分期標準將研究組患者分為增殖性視網膜病變（PDR）35例與非增殖性視網膜病變（NPDR）26例。納入標準：（1）2型糖尿病視網膜病變患者符合相關診斷標準［4］；（2）既往無眼部手術史者；（3）患者均簽署知情同意書。排除標準：（1）患有其它眼部疾病者；（2）患有血液病或代謝性疾病者；（3）患有1型糖尿病者；（4）嚴重肝腎功能不全者；（5）合并惡性腫瘤及免疫系統疾病者。兩組臨床資料比較差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 研究方法 （1）主要試劑：Trizol試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，反轉錄試劑盒購自Fermentas公司，qRT-PCR試劑盒購自美國Invitmgen公司，CXCR1與CXCR2兔抗人多克隆抗體購自Santa Cruz公 司。（2）qRT-PCR法 檢 測 兩 組 血 清 IL-8、CXCR1、CXCR2 mRNA表達水平：兩組受試人員于次日清晨抽取空腹靜脈血5 ml，并經簡單離心后吸取上層血清于抗凝試管中，按照Trizol試劑盒操作步驟提取總RNA。采用反轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄為cDNA。采用PCR試劑盒進行qRT-PCR反應并檢測IL-8、CXCR1、CXCR2 mRNA的相對表達量，反應體系為20μl：10μl 2×SYBR Mix，10×cDNA模板1uL，上下游引物各1μl，H20 8μl，反應程序設定為95℃ 5min（預變性），95℃ 30s（變性）、60℃ 30s（退火），72℃ 1min（延伸），共 30個循環，72℃ 10min（終延伸）。每個樣本設置3個平行反應復孔。在PCR儀上進行反應，其中引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，見表1。反應結束后對數據進行分析，其中IL-8、CXCR1、CXCR2均以GADPH作為內參按照2-ΔΔCt算法進行計算基因相對表達量。（3）Western blotting法檢測CXCR1、CXCR2蛋白表達水平：采用Western blotting法檢測CXCR1、CXCR2蛋白表達，血清中加入蛋白裂解液，采用玻璃勻漿器勻漿至組織破碎并在冰上裂解30min，簡單離心3min后將上清液轉移至另一EP管中測定蛋白濃度，取40μg蛋白樣品與上樣緩沖液混合煮5min，之后進行SDS-PAGE凝膠電泳并電轉移至PVDF膜。封閉液封閉并加入兔抗人CXCR1/CXCR2多克隆抗體（1：2000），4℃過夜并清洗后加入二抗室溫孵育120min，TBST清洗3次。采用ECL（增強化學發光法）試劑盒發光顯影并運用分析軟件對條帶灰度值進行分析，以β-actin為內參對顯影條帶進行計算CXCR1/CXCR2蛋白相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 測定及觀察指標 兩組受試人員均空腹12h后分別抽取靜脈血3ml，簡單離心后分離血清，采用全自動生化分析檢測腹血糖（FPG）、糖化血紅蛋白（HbAlc）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平，并分析上述指標與IL-8、CXCR1、CXCR2的相關性。

1.4 統計學方法 采用SPSS22.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數資料采用χ2檢驗；Pearson法進行相關性分析；Logistic法分析影響2型糖尿病視網膜病變的危險因素，各組數據均以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組臨床資料的比較 見表2。

表2 兩組臨床資料的比較（x±s）

2.2 兩組血清IL-8與CXCR1、CXCR2 mRNA及蛋白表達水平的比較 見圖1、表3、表4。

表3 兩組血清IL-8、CXCR1、CXCR2 mRNA表達水平的檢測結果（x±s）

表4 兩組CXCR1、CXCR2 蛋白表達水平的比較（x±s）

2.3 研究組患者血清IL-8與CXCR1、CXCR2及其與臨床指標的相關性分析 IL-8均分別與CXCR1、CXCR2呈顯著正相關（P＜0.05）。IL-8與FPG、TC、LDL-C、TG 及 HbAlc呈 顯 著 正 相 關（P＜0.05）；CXCR1與FPG、TC、TG呈顯著正相關（P＜0.05）；CXCR2與FPG、TC、LDL-C、TG 及 HbAlc呈顯著正相關（P＜0.05），且均與LDL-C水平無明顯相關性（P＞0.05）。

2.4 2型糖尿病患者發生視網膜病變的多因素分析 將影響2型糖尿病患者發生視網膜病變的多因素進行Logistic多元回歸分析，結果顯示IL-8、CXCR1、CXCR2、FPG及HbAlc均是2型糖尿病視網膜病變的危險因素。

圖1 CXCR1與CXCR2的蛋白表達情況

3 討論

本研究通過qRT-PCR法檢測2型糖尿病視網膜病變患者與健康人員血清中IL-8 mRNA表達水平，結果顯示研究組患者IL-8 mRNA表達水平顯著高于對照組，且PDR患者血清中IL-8 mRNA表達水平顯著高于NPDR，說明2型糖尿病視網膜病變患者血清中IL-8呈高表達并可參與疾病發生發展過程。相關研究表明2型糖尿病視網膜病變患者的臨床生化指標FPG、TG、TC、LDL-C、HbAlc等可通過誘導視網膜新生血管的形成進而影響疾病的發生發展［5］。本研究結果顯示，研究組患者FPG、TC、LDL-C、HbAlc均顯著高于對照組。說明2型糖尿病視網膜病變患者FPG、TG、TC、LDL-C、HbAlc在其產生及發展中發揮重要作用且與疾病嚴重程度密切相關。本研究對IL-8與患者的臨床指標進行相關性分析，結果顯示IL-8與FPG、TC、LDL-C、TG及HbAlc呈顯著正相關，說明IL-8表達水平升高可能與FPG、TG、TC、LDL-C、HbAlc相互作用進而促使視網膜新生血管的形成并導致病變的發生有關，患者血清中IL-8水平越高其疾病進展越快。CXCR1、CXCR2定位于人染色體2q35是CXCR家族的重要成員，其主要在中性粒細胞、T淋巴細胞及單核細胞中表達并可參與機體局部炎癥反應或全身性的應激反應。趨化因子CXCR1、CXCR2是由組織細胞與炎性細胞合成并分泌的堿基肝素結合型小分子蛋白，具有促血管生成及誘導炎性細胞趨化的作用并可與其相應趨化因子受體結合后發揮其生物學效應。本研究通過qRT-PCR法檢測其表達水平，結果顯示研究組患者CXCR1、CXCR2 mRNA表達水平顯著高于對照組，此外，Western blotting分析結果顯示研究組患者CXCR1、CXCR2蛋白表達水平顯著高于對照組，說明2型糖尿病視網膜病變患者體內CXCR1、CXCR2表達水平顯著升高，并參與視網膜病變的發生過程。同時本研究采用Pearson法將CXCR1、CXCR2表達與患者臨床指標進行相關性分析，結果顯示CXCR1與FPG、TC呈顯著正相關，CXCR2與FPG、TC、LDL-C及HbAlc呈顯著正相關，說明隨著2型糖尿病視網膜病變的進展加快，CXCR1、CXCR2表達也隨之發生變化，推測CXCR1、CXCR2可預測2型糖尿病視網膜病變的進展情況。

相關研究表明，IL-8與CXCR1、CXCR2結合后細胞胞漿區構象發生改變并可促使G蛋白釋放GDP進而與GTP結合，其可通過介導部分信號通路而促使甘油二酯及三磷酸肌醇的產生并可提高細胞內鈣離子濃度進而激活鈣調蛋白激酶并釋放活性產物最終引發機體炎癥反應。然而，IL-8與CXCR1、CXCR2結合后發揮的功能不同，研究表明IL-8與CXCR1結合后可介導中性粒細胞發生趨化并促使超氧化物的產生等生理過程，IL-8與CXCR2結合后可通過與巨噬細胞炎性蛋白等結合而參與血管形成及其它炎性疾病的發生過程［6］。本研究對IL-8與CXCR1、CXCR2的相關性進行分析，結果顯示CXCR1、CXCR2均與IL-8呈顯著正相關，說明2型糖尿病視網膜病變血清中IL-8通過與上調的CXCR1、CXCR2結合后并介導炎性細胞等向視網膜組織聚集及浸潤從而加重組織損傷。同時本研究對影響2型糖尿病患者發生視網膜病變的相關因素進行Logistic多元回歸分析，結果顯示IL-8、CXCR1、CXCR2、FPG及HbAlc均是2型糖尿病視網膜病變的危險因素。本研究結果顯示IL-8、CXCR1、CXCR2可通過促進機體內炎癥反應、血管生成而損傷視網膜組織并影響2型糖尿病視網膜病變的發生和發展，三者均與視網膜病變有關并可作為預測2型糖尿病視網膜病變患者病情進展的重要標志物。