多糖結構修飾研究進展

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(1.貴州師范大學,貴州省山地環境信息系統與生態環境保護重點實驗室,貴州貴陽 550001; 2.貴州師范大學,貴州省藥物質量控制及評價技術工程實驗室,貴州貴陽 550001; 3.貴州師范大學,天然藥物質量控制中心,貴州貴陽 550001)

多糖(Polysaccharide)是由10個及以上的單糖通過糖苷鍵連接縮合而成的多羥基醛酮類高分子聚合物[1],廣泛存在于動植物及微生物等有機體的細胞膜和細胞壁中,它不僅參與了細胞識別、生長、分化、代謝、胚胎發育、病毒感染、癌變、免疫應答等各種生命活動,還具有結構支持、能量儲存、防御等多方面的生理功能,是構成生命的四大基本物質之一[2]。大量研究表明,多糖具有多種生物活性,包括抗腫瘤、抗病毒、抗凝血、抗氧化、降血糖及免疫調節作用等活性;因此,關于多糖的研究日趨活躍起來。目前,多糖的生物活性、結構解析及構效關系已成為多糖研究的重點,也是醫藥學領域與食品保健行業共同關注的焦點。

盡管多糖被證實具有多種生物活性,但在研究過程中也陸續發現以下問題:自然界中并非所有的多糖都具有活性,例如,從桑白皮中分離出的多糖(CMA-a-1與CMA-b1-1),盡管來自同一植物體內,但多糖CMA-a-1卻不具有多糖CMA-b1-1所具有的抗肝癌活性[3];某些多糖會因受自身結構或理化性質的影響導致其生物活性難以發揮出來,例如,從密花石斛中提取出的密花石斛多糖,由于分子量太大導致其無法通過細胞膜障礙進入細胞發揮生物學效應[4],一種條斑紫菜多糖也因其分子量過大而不利于對胃癌細胞的抑制[5];某些從天然生物中分離出的多糖生物活性較弱,難以達到應用標準,需采取方法增強其生物活性;某些多糖雖然藥效不錯,但同時也產生一些不良反應,如某些硫酸化多糖因硫酸基過多而產生其它毒副作用[6]。

大量研究證明,多糖的生物活性或藥理性質直接或間接地受其分子結構的影響[7-8]。因此,為了解決以上問題,采取適宜的方法對多糖進行結構修飾以增強多糖的生物活性具有重要意義,對多糖進行結構修飾也已成為近年來國內外多糖領域研究的重點之一,它是研究多糖構效關系,探尋多糖生物活性根源的重要手段。

多糖的結構修飾主要是通過化學、物理學及生物學等手段對多糖分子結構進行修飾,通過改變多糖的分子結構、分子量、粘度及取代基的種類、位置及數量以實現其理化性質的改變、生物活性的增強甚至獲得新的生物活性多糖衍生物等。據目前的研究報道來看,多糖結構修飾的研究已取得了較大進展,其修飾方法主要分為化學方法、物理方法及生物方法,其中對多糖結構利用化學法進行化學修飾是多糖結構修飾中研究報道最多,應用范圍最廣的方法。本文以這三大方法為主線,化學修飾法為介紹重點,對近年來國內外多糖結構修飾研究進展進行綜述,為多糖結構修飾的深入研究與探索及糖類產品的開發與利用提供一定的參考。

1 化學修飾方法

對多糖結構進行化學修飾是當前多糖領域研究的重點之一。此方法通過對多糖殘基上的羥基、羧基、氨基等基團進行化學修飾,引入如硫酸基、羧甲基、烷基等不同種類的新基團以改變其空間結構、分子量數量等來增強其生物活性。化學修飾的方法多種多樣,目前常用的方法有硫酸化、羧甲基化、乙酰化、硒化、磺酰化、磷酸化、雙基團衍生化等。

1.1 硫酸化修飾

硫酸化修飾是多糖化學結構修飾最常用的方法之一。早在1987年,Nakashima等[9]就發現了天然海洋硫酸化多糖卡拉膠具有顯著的抗HIV活性,后來Nakashima等[10]又相繼報道了卡拉膠具有抑制單皰疹病毒復制的作用,至此硫酸化多糖逐漸引起了廣大科技研究者的關注;1988年,日本科學研究者Mizumoto等[11]首次成功在某些均多糖結構中引入硫酸基團后發現,此硫酸化多糖呈現出抗T-淋巴細胞病毒的活性,這一發現為日后硫酸化成為多糖化學結構修飾的重要方向之一奠定了基礎。

1.1.1 原理及修飾方法

1.1.1.1 原理 硫酸化修飾的原理是將多糖與相應的硫酸化試劑溶于一定的溶劑中,在一定的條件下相互反應,從而將硫酸基團引入原多糖殘基上的某些羥基上[12],以圖1中的反應為例,采用氯磺酸為主要試劑,多糖在路易斯堿溶液體系中,其羥基中的-H被-SO3H所取代,經反應完成后獲得多糖硫酸鹽。

圖1 多糖硫酸化反應(R為H或SO3Na)Fig.1 The sulfation reaction of polysaccharides(R is H or SO3Na)

1.1.1.2 修飾方法 硫酸化修飾多糖常用的方法主要有氯磺酸-吡啶法、濃硫酸法、三氧化硫-吡啶法、氨基磺酸-甲酰胺法、三氧化硫-二甲基甲酰胺法及氯磺酸-二甲基甲酰胺法等[13]。通常根據多糖分子主鏈的糖單元類型來選擇引入硫酸基團的方法,例如wolfrom法適用于吡喃型多糖[14],而Nagasawa法則適用于呋喃型多糖[15]。其中,氯磺酸-吡啶法、濃硫酸法及三氧化硫-吡啶法是最常用的3種方法。

氯磺酸-吡啶法因試劑易得,具有反應比較簡單徹底,產物回收率較高等優點,成為硫酸化修飾的一種理想方法,但在應用過程中要注意溫度的控制,溫度過高將有可能破壞多糖的結構。汲晨峰等[16]與李東霞等[17]采用氯磺酸-吡啶法分別對昆布多糖,鯊魚軟骨多糖及太白蓼多糖進行硫酸化修飾,結果都各自獲得了不同取代度的硫酸化多糖;經結構鑒定發現,昆布硫酸化多糖是一以β-(1→3)糖苷鍵為主鏈,C2-OH與C6-OH位為硫酸基取代位置的多糖,其硫酸基含量為45.92%,取代度為1.51;而鯊魚軟骨硫酸化多糖硫酸基取代在C-6位上,其硫酸基含量為19.6%,比未硫酸酯化前增加了6.1%。安樂等[18]與劉婕等[19]采用氯磺酸-吡啶法,以硫酸基取代度為指標,分別考察了太白蓼多糖與皺皮木瓜多糖硫酸化修飾的最佳條件,結果顯示,當氯磺酸與吡啶體積比為1∶10,反應溫度及時間分別為80 ℃和1 h時,太白蓼硫酸化多糖硫酸基取代度最高,數值為1.57;當v(氯磺酸)/m(多糖)=30 mL∶1 mg、反應溫度及時間分別為30 ℃和2 h時,皺皮木瓜硫酸化多糖硫酸基取代度最高,數值為2.41。

硫酸法與三氧化硫-吡啶法的制備過程相對較簡單,但取代度和產物回收率卻不是很高。朱影等[20]與欒琳琳等[21]采用濃硫酸法,分別對白背三七多糖和五味子葉多糖進行硫酸化修飾,結果獲得了硫酸基含量為13.70%,取代度為1.23的白背三七硫酸化多糖與取代度為0.46的五味子葉硫酸化多糖,其中,還發現白背三七多糖在硫酸化修飾的同時,其主體結構并未被破壞;而反應試劑配比為3∶1、反應溫度0 ℃和反應時間1.4 h則是五味子葉多糖硫酸化修飾的最佳工藝。王新宇等[22]分別采用氯磺酸-吡啶法和濃硫酸法對小刺猴頭菌多糖進行硫酸化修飾,結果表明,氯磺酸-吡啶法獲得的硫酸化多糖含硫量為11.64%,取代度為0.94,濃硫酸法獲得的硫酸化多糖含硫量為10.68%,取代度為0.82,證實氯磺酸-吡啶法更適合制備小刺猴頭菌多糖硫酸化衍生物。張秋平等[23]與杜挺挺等[24]分別考察了三氧化硫-吡啶法對樺褐孔菌多糖與厚殼貽貝多糖硫酸化修飾的影響,結果得出,當反應溫度為75 ℃,時間為1.5 h,反應摩爾濃度比為1∶3.5時,樺褐孔菌硫酸化多糖硫酸基取代度達到最高值0.97;而當反應溫度為90 ℃,時間為6 h,三氧化硫與吡啶體積比為1∶6時,厚殼貽貝硫酸化多糖得率為34%,且修飾后硫酸根含量從6.51%提升到32.95%,取代度從0.12提升到0.86。

除以上幾種常用方法外,吳素珍等[25]、周本宏等[26]與王歡等[27]也均采用氨基磺酸-甲酰胺法分別獲得了當歸多糖硫酸化衍生物(硫酸基含量13.69%,取代度為1.23),天麻多糖(GEP)硫酸化衍生物(GEPs取代度為0.59,GEPsⅡ取代度為0.64)與黨參多糖硫酸化衍生物(取代度為0.75)。

1.1.2 硫酸化修飾對多糖生物活性的影響 大量研究事實證明,硫酸化修飾多糖可增強其生物活性,如今,硫酸化多糖也因其突出的抗病毒(抗HIV病毒、流感病毒、巨噬細胞病毒)、抗腫瘤、抗凝血等活性在實際生產過程中應用最為廣泛。Miao等[28]采用氯磺酸-吡啶法對馬尾藻多糖進行化學結構修飾,獲得取代度為0.803的馬尾藻硫酸化多糖,與未修飾前相比,馬尾藻多糖硫酸酯對HepG2細胞的增長呈現出一定的抑制作用,證實馬尾藻的硫酸化多糖能有效增強其抗腫瘤活性的發揮。Geng等[29]采用氯磺酸-吡啶法對馬尾松花粉多糖進行化學結構修飾,獲得馬尾松硫酸化多糖,并研究了其對RAW264.7巨噬細胞免疫功能的影響,結果顯示,馬尾松硫酸化多糖具有抑制巨噬細胞的免疫功能,這是由于SPPM60-D與巨噬細胞上的TLR4結合激活了TLR4-PI3K-PLC-IP3R信號通路,導致CRAC通道的開放,增加了[Ca2+]i并激活了巨噬細胞,從而促使了免疫功能的提高。Malagoli等[30]通過對紅藻(L.muelleri)的兩種硫酸化多糖Fra-B1和Fra-B2進行探究發現,Fra-B1和Fra-B2均能抑制1型和2型單純皰疹病毒(HSV-1和HSV-2),可阻止單純胞疹病毒(HSV)的吸附,防止其穿透細胞,是一種新的抗HSV劑。

此外,相關研究發現,硫酸化多糖的生物活性與其分子結構中的硫酸根有著密切關系,在多數硫酸化多糖中,若將硫酸根去除,其生物活性尤其是抗病毒活性均會消失,原因可能是硫酸化多糖的抗病毒活性與糖鏈空間結構有關,多糖進行硫酸化修飾后,糖鏈柔性降低,進而表現出抗病毒活性,但并非硫酸根的數量越多生物活性就越強,硫酸根數量過多會導致抗凝血等副作用或其它毒副作用的產生,一般平均每個單元的糖殘基中含1.5～2.0個硫酸根最為適宜[6]。

1.2 羧甲基化修飾

羧甲基化修飾具有試劑易得、成本較低、制備過程簡單及反應所生成的物質低毒或無毒等優點,已成為多糖化學結構修飾較為常用的方法之一。相關研究表明,某些多糖具有良好的抗腫瘤活性,但因其分子量過大,溶解性能差導致多糖的廣泛應用受到限制,而對多糖結構進行甲基化修飾,能有效提高多糖的水溶性,對多糖生物活性的發揮尤其是抗腫瘤活性的發揮具有重要作用。

1.2.1 原理及修飾方法

1.2.1.1 原理 羧甲基化修飾的原理是將多糖與一氯乙酸在堿性的條件下相互反應,從而將羧甲基引入原多糖殘基上的某些羥基上,如圖2所示,以茯苓多糖羧甲基化反應為例[31],采用一氯乙酸為主要試劑,多糖在堿性環境中,其某羥基中的-H被ClCH2COO-所取代,經反應完成后獲得羧甲基化多糖。

圖2 茯苓多糖羧甲基化反應Fig.2 The carboxymethylation reaction of pachymaran注：R1、R2、R3代表取代基ClCH2COO-或H, 羧甲基反應一般取代C-6位。

1.2.1.2 修飾方法 對多糖結構進行羧甲基化修飾主要有溶媒法和水媒法兩種方法。

溶媒法是指將一定量的多糖懸浮于如甲醇、乙醇、丙酮等有機溶劑中,在堿性條件下反應一段時間后加入一氯乙酸,于適當溫度下進行醚化反應,即得羧甲基多糖。曹莉莉等[32]采用氫氧化鈉-異丙醇-氯乙酸鈉反應體系,以羧甲基取代度為指標對余甘多糖進行羧甲基化修飾,經紅外光譜顯示COO-成功接入余甘多糖,證實羧甲基化余甘多糖制備成功,其取代度為0.961。張洋婷等[33]采用氫氧化鈉-乙醇-氯乙酸反應體系,以羧甲基取代度為指標對紅景天多糖進行羧甲基化修飾,通過正交試驗確定羧甲基化紅景天多糖的最佳條件為反應溫度60 ℃、氯乙酸15 mg、反應時間3.5 h,得出最佳取代度為15.07。陳義勇等[34]采用氫氧化鈉-異丙醇-氯乙酸反應體系,以羧甲基取代度為指標對杏鮑菇多糖進行羧甲基化修飾,結果表明,當NaOH為2.98 g,氯乙酸為2.51 g,反應時間為4 h,反應溫度為60 ℃時,羧甲基杏鮑菇多糖取代度可達0.891。

水媒法是指將一定量多糖用稀堿溶液溶解后加入適量一氯乙酸,再在適當的溫度下進行醚化反應,即得羧甲基多糖。申林奔等[35]以苦豆子多糖為原料,采用氫氧化鈉-氯乙酸鈉反應體系,以羧甲基取代度為指標,通過正交實驗確定了其最優反應條件:原料為50 mg,在氯乙酸鈉0.5 g,反應溫度55 ℃,反應時間5 h,氫氧化鈉濃度25%的優化條件下羧甲基基團取代度可達1.50以上,且紅外光譜分析表明,該方法成功引入羧甲基基團。韋毅銘等[36]與謝靜南等[37]采用氫氧化鈉-一氯乙酸反應體系,以羧甲基取代度為指標分別對龍眼肉多糖和甜玉米芯多糖進行羧甲基修飾,結果發現,當一氯乙酸濃度1.2 mol/L、反應溫度73 ℃、反應時間3.2 h時,龍眼肉羧甲基化多糖取代度可達1.053,當NaOH溶液濃度4.0 mol/L,溫度45 ℃,一氯乙酸用量2.360 g時,甜玉米芯羧甲基化多糖取代度最高為0.0516。

溶媒法具有反應過程迅速,主反應速度快且穩定,副反應少,醚化劑利用高等優點,但由于應用過程中使用大量有機試劑導致物耗提高,有機試劑分離回收困難,生產成本也較高;水媒法具有設備簡單、投資少、成本低等優點,但產品質量不均勻、醚效低,生產出產品粘度低、副作用較多,后處理比較困難。

1.2.2 羧甲化修飾對多糖生物活性的影響 將多糖結構進行羧甲基化修飾后,其水溶性大大提高,多糖生物活性的發揮也跟著增強了。經大量的研究報道證明,羧甲基化后的多糖能呈現出較強的抗腫瘤、抗氧化、抗疲勞及免疫調節等生物活性。

Surhio等[38]通過對粒毛盤菌屬的胞外多糖及其羧甲基化衍生物的抗疲勞活性研究中發現,它們均能抑制運動過程中血清尿素氮和血液乳酸含量的積累,延長運動耐久性,同時兩者均能改善小鼠的抗氧化防御機制,但是研究發現,在相同劑量下,羧甲基化衍生物比未修飾前更能增強小鼠的耐受能力延緩小鼠疲勞,這表明羧甲基化可以增強粒毛盤菌多糖的抗疲勞活性,可被用作一種醫療手段來抵抗疲勞和增加體力。Liu等[39]對菌絲體羧甲基化多糖研究發現,其羧酸酯基團的取代主要出現在C-6位上,通過比較,羧甲基化能顯著提高菌絲體多糖的抗氧化活性和抗菌活性,其中中等取代度和穩定三螺旋結構的菌絲體羧甲基化多糖具有最大的DPPH自由基清除能力、還原能力、金屬螯合活性和抗菌活性。Shi等[40]為了改善苔菜多糖(PE)的生物活性,將其降解為低分子量多糖(DPE),之后又對其進行羧甲基化獲得羧甲基化多糖(CDPE),經過對PE、DPE及CDPE的抗氧化分析發現,在各樣品濃度均為4 mg/mL時,CDPE對DPPH的清除率達到36.2%,而DPE和PE分別為19.8%和11.3%,CDPE對超氧陰離子自由基的除率達到61.1%,而DPE和PE分別為49.7%和28.7%,CDPE具有更強的抗氧化活性。

1.3 乙酰化修飾

乙酰化修飾因具有反應速度快、反應溫和、產物轉換率高等優點成為多糖化學結構修飾中常用的分子修飾方法之一。乙酰化修飾通過改變多糖的定向性和橫向次序改變多糖的理化性質。經乙酰化修飾后的多糖會導致分子結構伸展的產生變化,致使自身分子結構中的羥基暴露在外,增大了多糖的溶解度,從而影響多糖生物活性的發揮[41]。

1.3.1 原理及修飾方法

1.3.1.1 原理 乙酰化修飾作為常用的修飾方法之一,其通過在多糖分子支鏈上引入乙酰基達到增強其生物活性的目的。通常采用乙酸或者乙酸酐為多糖乙酰化的主要試劑,在適當的條件下,多糖分子結構上的活性羥基基團可與相應試劑發生親核取代反應,生成乙酰化多糖酯,如圖3所示,在甲苯、高氯酸存在的條件下,纖維素與乙酸酐發生全乙酰化反應。

圖3 纖維素的全乙酰化Fig.3 Complete acetylation of cellulose

1.3.1.2 修飾方法 乙酸酐-吡啶法是乙酰化修飾多糖常用的方法,此法主要為將多糖充分溶解于一定的有機溶劑(吡啶、甲醇、甲酰胺、DMAc/LiCl等)中,然后加入合適的乙酰化試劑(乙酸或乙酸酐)進行修飾反應,通常氨基氮和羥基氧是乙酰基取代的多取代點[42]。郭曉強等[43]在氫氧化鈉水溶液的均相體系中以乙酸酐為酰化試劑對銀耳多糖進行乙酰化修飾,在本實驗條件下獲得了低取代度0.214的乙酰化銀耳多糖。楊春瑜等[44]以甲酰胺為溶劑,乙酸酐為酰化試劑,N-溴代琥珀酰亞胺(NBS)為催化劑對黑木耳多糖進行乙酰化修飾,結果得到,制備乙酰化黑木耳多糖的最優實驗條件為,反應時間3.5 h,反應溫度80.0 ℃,乙酰化試劑用量32.5 mL,NBS添加量為1.0%,在此實驗條件下,得到的乙酰化取代度平均值為0.55。黃丹菲等[45]采用乙酸酐為乙酰化試劑,以大粒車前子多糖為原料,對其進行乙酰化修飾,當乙酸酐體積分數為10%、反應溫度為30 ℃、時間為2.5 h時,取代度達最高值為0.094,其中,反應溫度和乙酸酐體積分數是影響多糖乙酰化反應取代度的主要因素。

1.3.2 乙酰化修飾對多糖生物活性的影響 乙酰化修飾通過向多糖分子中引入乙酰基團來改變其生物活性的強弱。曾有美國學者報道指出多糖的生物活性隨乙酰基含量的增大而增強,但隨著研究的不斷深入,研究人員發現多糖生物活性的強弱并非與其乙酰基含量呈正相關,例如,地衣類多糖石臍素β(1→6)-D-葡聚糖,將其部分乙酰化后,乙酰基的引入使多糖分子結構產生變化,使其呈現出抗腫瘤活性,而當再將其脫乙酰化或全乙酰化后,其呈現出的抗腫瘤活性又消失了[46]。經大量研究發現,乙酰化多糖中乙酰基的數量及取代位置與多糖的活性存在構效關系,例如,當多糖分子中O-3位被乙酰基取代時,多糖的抗腫瘤活性明顯增強;而當O-5位被乙酰基取代時,其抗腫瘤活性明顯減弱;當O位被乙酰基全部取代時,多糖的活性則完全消失;其原因可能是乙酰基團的引入改變了多糖糖鏈分子的空間排布,進而導致了生物活性的變化[47]。因此,根據不同的性質,采取不用的方案,達到預期的目的是值得深入研究的方向之一。

乙酰基團的引入還可使多糖呈現出顯著的抗氧化、抗凝血及免疫調節活性等。Deng等[48]從石斛中分離得到一種具有生物活性的石斛多糖,研究結果表明,此多糖在水溶液中呈球形,含有β-1,4-D-Manp構架并且在某些甘露糖殘基的O-2或O-3位置上被乙酰基多取代,研究顯示石斛多糖對RAW 264.7巨噬細胞表現出免疫調節功能。Liu等[49]研究了青錢柳葉多糖與其乙酰化衍生物對RAW264.7巨噬細胞的潛在免疫調節活性,結果表明乙酰化多糖能明顯促進巨噬細胞的增殖,且作用明顯強于未修飾的多糖。王之珺等[50]對青錢柳乙酰化多糖進行自由基清除實驗,結果顯示乙酰化修飾可顯著提高青錢柳多糖的抗氧化活性。

1.4 硒化修飾

硒是人體生命活動的必需元素,可增強機體的抗氧化能力,在防癌抗癌方面起著重要的作用。硒和多糖都具有多種生物活性,都可對疾病進行防治,相關實驗證實,將硒和多糖有機結合在一起形成的硒多糖具有多種生物活性,其可通過提高相關酶的活性來拮抗重金屬中毒和抗活性氧損傷的能力,可使癌細胞DNA合成受阻而抑制癌細胞生長等[51]。硒多糖不僅兼顧了硒和多糖的活性,且活性高于兩者,更易被機體吸收利用,因具有低毒性、低副作用及易吸收等優點受到了廣大科技研究者的關注,盡管目前對于硒和多糖活性的研究已取得巨大成果,但將硒和多糖有機結合在一起合成的硒多糖方面,國內外相關研究仍然處于發展中狀態。開展硒多糖的合成具有重要意義。

1.4.1 原理及修飾方法 許多動植物和微生物體內都含有天然硒多糖,特別是在植物體內。但研究人員發現生物體內的天然硒多糖的含量少之又少,遠遠達不到研究要求,這使得硒多糖的研究受到了限制。因此,必須采取方法,對多糖進行硒化修飾或者其它方法獲取硒多糖。硒多糖的化學結構不同于普通多糖,它含有特殊的硒氧鍵,其中在一定條件下利用無機硒(單體硒、亞硒酸或亞硒酸鈉)與多糖反應對其進行硒化修飾是目前對多糖進行硒化修飾最常用的方法。張越峰等[52]以紅棗多糖為原料,亞硒酸為主要試劑與其進行硒化反應,通過紅外光譜證實,硒在紅棗多糖中以硒酸酯的形式存在。李志洲等[53]與陳文霞等[54]以亞硒酸鈉法分別考察了豬苓多糖及紋黨參多糖硒化修飾的最佳工藝,其中,當亞硒酸鈉溶液與豬苓多糖溶液流量配比1∶1,反應溫度70 ℃、反應釜內硝酸的濃度0.008 mL/mL,超聲輔助合成頻率為30 kHz,其合成率達26.5 mg/g;當反應時間為5 h,反應溫度 60 ℃,投料比1∶1時,硒化紋黨參多糖中含硒量可達1.07 mg/g,產率可達50.3%。吳秀欽等[55]也運用亞硒酸鈉法,在不同時間、溫度及亞硒酸鈉濃度條件下對太子參多糖進行正交硒化修飾,最終得到9種硒化太子參多糖。

除此之外,還可以在適宜培養條件下將無機硒添加到真菌、藻類等的培養基中,通過真菌、藻類等的生長代謝,對硒進行富集和生物轉化來獲得硒多糖,此法獲得的硒多糖不僅含量高且種類繁多[56]。

1.4.2 硒化修飾對多糖生物活性的影響 硒多糖兼有硒的強抗氧化性和多糖的抗腫瘤、抗病毒及抗輻射等兩者的生物活性,在醫藥和食品等領域有著廣泛的應用前景。Wang等[57]使用H2SeO3/HNO3和BaCl2作為催化劑合成了具有高硒含量的硒化沙蒿多糖,研究發現,硒化結構主要在多糖分子結構中的C-6位上,與原沙蒿多糖相比,硒化沙蒿多糖呈現出更強的清除羥基和超氧自由基活性。Gao等[58]從O. radicata的菌絲體中成功獲得硒多糖(SMPS)和多糖(MPS),并且研究它們的抗氧化能力,抗肺損傷活性及單糖組成,結果顯示SMPS和MPS都具有潛在的抗氧化活性和對LPS誘導的肺損傷有顯著的保護作用。Mao等[59]對硒化灰樹花多糖進行研究發現,硒化灰樹花多糖可通過提高荷瘤小鼠的免疫功能而間接發揮抗腫瘤作用。

1.5 磷酸化修飾

磷酸化修飾是多糖化學結構修飾常用的方法之一,與其它化學修飾一樣,它也是一種對分子支鏈的共價修飾。多糖分子經磷酸化修飾后,其抗腫瘤、抗凝血等生物活性得到明顯提高,因此受到相關領域的關注。

1.5.1 原理及修飾方法 磷酸化修飾的原理是將多糖與磷酸化試劑相互反應,從而將磷酸基引入多糖殘基上的某些羥基上。目前,磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉及三聚磷酸鈉等磷酸鹽因廉價易且不易引起多糖的降解常用于多糖的磷酸化。

Passauer等[60]在淀粉加入一定量的磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉混合鹽水,攪勻烘干,將干燥的混合物于高溫下制得磷酸化淀粉,但其反應活性低,不易獲得高取代度產物。倪海鈺等[61]以淫羊藿多糖為對象,使用三聚磷酸鈉和三偏磷酸鈉混合試劑作為磷酸化試劑,對淫羊藿多糖進行磷酸化修飾,結果顯示,當三聚磷酸鈉與三偏磷酸鈉比為5∶2,反應溫度97 ℃,反應時間2.8 h,反應pH8.7時,磷酸化淫羊藿多糖磷酸根含量可達(6.012±0.021)。馮小玲等[62]以三聚磷酸鈉和三偏磷酸鈉為原料對裂褶多糖進行磷酸化修飾,當反應條件為m(三聚磷酸鈉-三偏磷酸鈉):m(裂褶多糖)=2∶1,反應溫度60 ℃,反應時間3 h時,其反應取代度最佳,為0.052。總的來說,相對其他化學修飾方法,關于磷酸化修飾研究的報道較少,其如何在多糖殘基上發揮作用的機理機制也尚未明確,還待進一步研究。

1.5.2 磷酸化修飾對多糖活性的影響 磷酸化多糖具有很強的抗腫瘤、抗病毒及免疫調節等生物活性,對多糖相關產品的研究開發具有重要作用。Deng等[63]對竹蓀多糖與竹蓀磷酸化多糖研究發現,竹蓀磷酸化多糖表現出令人滿意的水溶性且抗氧化性活性的顯著增加,與竹蓀多糖相比,竹蓀磷酸化多糖對MCF-7和B16腫瘤細胞的生長也顯示出更顯著的抑制作用。孫婕等[64]對南瓜多糖與南瓜磷酸化多糖進行研究發現,南瓜磷酸化多糖在清除羥基自由基和超氧陰離子自由基能力方面均強于未修飾的南瓜多糖,具有更強的抗氧化活性。楊萍[65]研究了銀耳磷酸化多糖對輻射損傷小鼠造血功能的影響發現,銀耳磷酸化多糖具有保護機體的造血組織,拮抗白細胞降低的功效,為腫瘤治療領域開發低毒、高效的新靶點藥物提供了科學依據。寧苑靈[66]對龍眼肉磷酸化多糖研究發現,龍眼肉磷酸化多糖具有提高環磷酰胺致免疫低下小鼠的免疫功能作用及抗小鼠肝脂質過氧化作用。

1.6 其他化學修飾方法

多糖的化學結構修飾除以上幾種方法外,還有磺酰化修飾、烷基化修飾、雙基團衍生化修飾、棕櫚酰化修飾、硝酸酯化修飾及碘化修飾等。

其中,磺酰化修飾是將多糖與磺酰化試劑(對甲基苯磺酰氯或苯磺酰氯)在一定條件下進行反應,使多糖支鏈上的羥基被磺酰基所取代的一種修飾方法(以圖4[67]中淀粉的磺酰化為例),多糖通過磺酰化修飾,可增強其原有生物活性或產生新的生物活性,另外磺酰基的引入除了可對多糖進行結構修飾以外,還可作為多糖結構中羥基的保護基團[68]。

圖4 淀粉的磺酰化反應Fig.4 Sulfonylation of starch

近年來,關于磺化多糖的生物活性報道較少,張強[69]將茯苓多糖進行磺酰化修飾后獲得磺酰化茯苓多糖,研究發現其具有較好的清除自由基的能力,并對Fe3+有不同程度的還原作用,可作為一種天然的抗氧化劑。

某些多糖因粘度高、溶解度低等阻礙了其生物活性的發揮,烷基化修飾多糖可使其水溶性增大,增強其生物活性。通常采用鹵化烴為多糖烷基化試劑,通過向多糖主鏈中引入不同長度或類型的烷基、取代烷基或長鏈芳香醇實現多糖的甲基化修飾。烷基化部位常為N或羥基,以圖5殼聚糖氨基氮的烷基化為例[70]。

圖5 殼聚糖的烷基化反應Fig.5 The alkylation reaction of chitosan注：R為乙基、丁基、辛基、十六烷基等。

對于烷基化修飾多糖,近年相關報道也比較少,黃玉芬等[71]研究發現,在殼聚糖的C2位上引入一定數量的十八烷基苯基團進行疏水改性后,可顯著提高殼聚糖的凝血性能,但并非烷基程度越高,凝血能力越強,凝血能力受烷基化程度的影響。另外,在一些報道中發現烷基化對硫酸多糖的抗艾滋病毒活性有促進作用,如硫酸化烷基寡糖,因其烷基部分可與病毒囊膜脂雙層作用,致使囊膜破裂,從而達到抗艾滋病毒的功效。

另外,雙基團衍生化修飾解決了單一基團衍生化可能存在的修飾后生物活性仍不理想的弊端,如殼聚糖經羧基化修飾后再磺酰化修飾能呈現出較高的抗凝血活性[72],但不便于操作和相關條件的控制;此外,另有報道發現,多糖分子結構中的羥基和肽鍵與金屬離子絡合形成的復合物能使其呈現新的活性,這對多糖化學結構修飾方法的研究具有重要意義[73]。

2 物理修飾方法

研究發現,多糖因分子量大、空間結構復雜及聚合度高等阻礙了其生物活性的發揮,對多糖結構進行物理修飾可達到增強其生物活性的目的,而且相對于化學修飾,物理修飾還具有節約能源、操作簡便、降低化學反應產物對環境的破壞等優點。目前,對多糖進行物理修飾應用比較廣泛的主要有超聲波降解修飾和離子輻射修飾兩種方法。

超聲波降解因具有降解過程和降解程度容易控制,獲得的產物分子量小,易獲得目標分子量,且不引入新物質,對多糖的結構不會造成破壞,不影響其固有的生物活性等優點,目前已成為國內外關注的熱點之一。其主要通過切斷多糖大分子中的某些化學鍵以降低多糖分子量,增加其水溶性來提高多糖生物活性,此法廣泛應用于多種大分子生物如葡聚糖、殼聚糖及其他天然多糖等的結構修飾。王振斌等[74]對超聲波修飾前后的無花果多糖進行抗氧化活性分析和分子結構表征,經過超聲波處理,多糖的C-O-C和C-O-H鍵被超聲波大量打斷,斷裂為分子量較小的多糖,數均分子量和重均分子量分別從536800、1061000 Da減少到46410、93870 Da,分子量分布寬度由1.98變成2.02,對修飾后的多糖進行醇沉和葡聚糖凝膠G-150層析,得到一種抗氧化能力較強的組分。Tang等[75]采用超聲波降解青錢柳葉多糖后發現,與未降解多糖相比,超聲波降解后多糖具有更好的DPPH清除活力和羥自由基清除活力。王鶴等[4]采用超聲波降解密花石斛多糖后發現,與未降解多糖相比,超聲降解后的多糖不僅分子量和特性粘度降低了,還顯著提高了多糖促進脾細胞增殖的活性。Yu等[76]采用超聲波降解條斑紫菜多糖后發現,與未降解多糖相比,超聲波降解后的多糖對胃癌細胞SGC7901和95D細胞的抑制能力都明顯增強了。

離子輻射修飾主要是利用r射線、X射線及電子束等電離輻射誘導多糖發生物質聚合、交聯、接枝或降解等物理化學變化以改變多糖的分子結構提高其生物活性,但近年來關于此方法的相關研究并不是很多。張慧等[77]為了改善陽離子淀粉的性質,采用微波輻射與半干法結合工藝制備陽離子淀粉,結果顯示:相比半干法工藝,微波半干法對陽離子支鏈淀粉的降解作用更明顯,微波半干法陽離子淀粉較半干法樣品的溶解度、透光率和凍融穩定性提高,峰值黏度及終黏度降低。程德山等[78]采用Co60輻射對淀粉甲基丙烯酸羥乙酯接枝改性,制備接枝淀粉漿料,通過試驗得出接枝改性的最佳工藝參數為:混合反應介質(水)含量28%,甲基丙烯酸羥乙酸與淀粉配比6%,輻射劑量率10 Gy/min,輻射劑量6 kGy。

3 生物修飾方法

隨著科學技術的發展,通過生物修飾對多糖的合成途徑進行控制或者改變多糖分子的主鏈結構提高其溶解度也可改變多糖生物活性。目前,對多糖結構進行生物修飾應用得比較廣泛的方法有基因工程技術和酶法修飾兩種。

眾所周知,微生物具有繁殖速度快的特點,此特點為大量生產微生物活性多糖提供了可能。但研究發現,許多天然的微生物多糖并不具備理想的活性結構,因此對其進行結構修飾獲取理想的活性結構具有重要意義。基因工程技術通過操縱微生物基因的表達或引入外源基因等,來控制多糖在微生物體內合成的途徑從而獲取所需的多糖。Jamas等[79]在一野生酵母菌中引入外源基因使胞內多糖結構發生變化,與修飾前的多糖相比,修飾后的多糖支鏈取代度不僅提高了,且空間結構也變得更加舒展,重要的是多糖的抗腫瘤活性得到了顯著增強。盡管如此,基因工程技術也因其操作的不穩定性、外源基因獲取困難等缺點而發展受阻,但從初期的發展情況來看,其在多糖結構修飾方面仍有著廣闊的前景。

酶法修飾因其反應具有專一性強、操作簡便、無或低副作用、高效性、環境友好及降解條件溫和且易控制等優點在多糖的分子結構修飾中日益受到重視。糖苷酶是酶法修飾中使用最多的一種酶,它通過對多糖主鏈的降解作用,提高多糖的溶解度,從而利于多糖生物活性的發揮。余志等[80]以糖苷酶溶液為修飾酶,研究了酶法修飾茶多糖對環磷酰胺抑制免疫低下模型小鼠的免疫功能的影響,與修飾前多糖相比,修飾后的多糖能明顯提高小鼠脾指數、腹腔巨噬細胞吞噬率和吞噬指數,能顯著提高DTH試驗耳腫程度、血清HC50、NK細胞活性,證實酶法修飾能增強綠茶多糖的免疫活性。賈俊強等[81]采用α-淀粉酶對蛹蟲草多糖多糖進行酶法修飾,研究發現,酶法修飾后的蛹蟲草多糖對DPPH自由基的清除率比修飾前提高了55.1%,證實酶法修飾能顯著提高蛹蟲草多糖的抗氧化活性。夏新奎等[82]采用α-淀粉酶對薤白多糖進行酶法修飾,并用鄰苯三酚自氧化法測定修飾產物的抗氧化活性,結果表明,酶法修飾能顯著增強薤白多糖的抗氧化活性。不過,目前酶法修飾技術在多糖結構修飾中的應用僅限于對某些多糖降解的酶類,積極開發其它如轉移酶、合成酶等類型的酶,豐富酶法修飾技術在多糖結構修飾中的應用具有重要意義。

4 結論與展望

不同的方法具有不同用途,根據不同多糖的理化性質以及不同用途的需求,來選擇適合的修飾方法才能得到更好的效果。

盡管多糖結構修飾的研究已取得了不小成果,對于多糖的結構修飾人們也已熟練掌握了多種方法,但其仍各自存在著不同的缺點,如化學修飾方法雖針對性強,能針對某個部位改變其結構形式及狀態從而獲得目標多糖的某種生物活性,但其使用的有機試劑后續處理困難容易造成環境的污染,且反應過程不易控制容易引入雜質使多糖產生副作用;物理修飾方法雖操作簡便,對多糖的結構不易造成破壞且對固有的生物活性不產生影響,但禁錮了目標多糖新活性的開發和利用;生物修飾方法雖專一性強、操作簡便及反應條件溫和易控制,但方法比較單一,其中的酶法修飾技術酶類的選擇更是少之又少;不僅如此,現有的結構修飾方法其機理機制的研究也存在著不夠深入還比較模糊等缺點,這些因素都不同程度影響著多糖結構修飾研究的發展,間接也影響著多糖構效關系的發展。

因此,在科學技術的指導下,對于未來多糖結構修飾的研究,還需做到以下幾點:對現有方法取長補短,嘗試聯合多種方法對多糖結構進行定向修飾;多開展多糖結構修飾方法的探討,進一步弄清已有方法的機理機制;勇于創新,尋找新的適合于不同類型多糖的修飾方法;加強改性后多糖構效關系的研究,明確結構修飾的位點、數量等結構表征與活性之間的相關性的研究。總的來說,對于多糖結構修飾的研究目前還處于發展階段;不過,隨著多糖結構修飾方法和相關領域科學技術的日趨完善和提高,相信多糖的開發和利用會越來越好。