乳酸菌細菌素研究進展 及其在水產養殖和加工中的應用

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(1.上海理工大學醫療器械與食品學院,上海 200093; 2.中國水產科學研究院東海水產研究所,上海 200090; 3.福建省閩東水產研究所,福建寧德 352100)

我國是水產養殖大國,養殖產量自1990年開始連年居世界首位,消費者對水產品的需求量也日益增加[1]。然而,水產品在養殖、加工儲運過程中易受到有害微生物的侵害和污染,這就影響水產品的養殖產量及食用安全。常用抑菌方式有通過添加抗生素等抑菌物質以及采用高溫高壓滅菌等滅菌方式來抑制水產養殖及加工過程中有害微生物的侵染[2]。然而高溫高壓滅菌會引起水產品中熱敏性營養成分的流失,造成其品質和營養價值的下降;防腐劑、保鮮劑等食品添加劑可能對人體具有潛在危害;抗生素在水產養殖過程中的過度使用,會造成養殖水體、水產品的污染和耐藥性細菌的產生[3]。當前耐藥性致病菌在水產品中發現頻率越來越高,已經嚴重威脅到人類健康安全,引起了水產養殖業及加工業極大地關注[3]。因此尋求天然、安全和高效的抑菌劑對水產品加工及養殖行業發展具有一定的促進作用。

細菌素是一類由核糖體合成,對同種或種屬關系較近的細菌具有抑制作用的多肽或蛋白質[4]。與傳統的抗生素不同,細菌素由基因編碼,核糖體合成,抗菌譜較窄、抑制目標微生物具有特異性強的特點,因此細菌素抑菌效能高。抗生素是由微生物發生酶促反應而合成的次級代謝產物,抗菌譜較細菌素廣,而抑菌效應較細菌素低。抗生素作用方式比較多,可以通過阻礙細胞壁合成、增強細胞膜的通透性、抑制蛋白質合成、阻礙DNA復制及轉錄、影響細菌的代謝等方式達到抑菌效果[4-5];而已知的細菌素抑菌作用方式單一,主要是通過形成孔道或者溶解細胞膜來對細菌進行抑制[4]。

乳酸菌被普遍認為是安全的微生物,因此乳酸菌細菌素也可當做傳統食品添加劑和抗生素的替代品[6]。然而,目前乳酸菌細菌素中只有乳酸鏈球菌素(nisin)通過FDA/WHO認證,并進行產業化生產,其主要原因是大部分乳酸菌細菌素的作用機理研究得不夠清楚,從而影響了乳酸菌細菌素的進一步應用[6-7]。本文根據現有乳酸菌細菌素的研究進展,按照乳酸菌細菌素的特征進行分類,并闡述其抑菌機理,總結乳酸菌細菌素在水產養殖及加工方面的應用研究,為乳酸菌細菌素的進一步應用提供參考。

1 乳酸菌細菌素的分類

乳酸菌細菌素的分類較復雜,且一直存在爭論[8-12]。Klaenhammer[8]將細菌素分為四類:I類是以乳鏈菌肽為代表的低分子量(<5 kDa)的羊毛硫抗生素類熱穩定肽;II類為小分子量(<10 kDa)非羊毛硫抗生素類熱穩定肽,包括IIa、IIb和IIc三個亞類;III類是高分子量(>30 kDa)的熱不穩定肽;IV類是肽與碳水化合物或脂質的復合物。Cleveland等[9]認為IV類細菌素是未完全純化的一類細菌素,所以不是一類新的細菌素。Cotter等[10]提出了一種新的分類方法,將細菌素分為兩類:羊毛硫抗生素類細菌素(I類),非羊毛硫抗生素類細菌素(II類),將III類細菌素定義為溶菌素,取消了IV類細菌素的分類。Drider等[11]根據細菌素的生化特征將乳酸菌細菌素分為三大類:I類是熱穩定的短肽(19～38氨基酸殘基);II類由具有兩親螺旋結構的小型熱穩定肽(<10 kDa)組成;III類是有復雜活性和蛋白質結構的大分子量的(>30 kDa)熱不穩定細菌素。根據細菌素的生物、物理、遺傳特性以及抑菌作用等特點,將乳酸菌細菌素分為四類(見表1)。

表1 乳酸菌細菌素的分類Table 1 Classification of bacteriocins produced by LAB

1.1 I類乳酸菌細菌素

I類乳酸菌細菌素是短肽/羊毛硫抗生素類抑菌肽(<5 kDa,19～37個氨基酸),其一級結構中含有氨基酸羊毛硫氨酸和甲基羊毛硫氨酸[25-26]。I類乳酸菌細菌素是翻譯后修飾的熱穩定肽,該類細菌素通常對革蘭氏陽性菌有高效的抑制作用[27]。根據形態的不同又可以分為兩個亞類:Ia類和Ib類乳酸菌細菌素。Ia類乳酸菌細菌素是細長型的,分子量在2～4 kDa之間,nisin是這類細菌素的典型代表[13-14]。Ib類乳酸菌細菌素是典型的球狀,分子量在2～3 kDa之間,帶負電荷或無凈電荷的細菌素[28]。

1.2 II類乳酸菌細菌素

II類乳酸菌細菌素是具有熱穩定性,分子量小(<10 kDa),類似片球菌素的非修飾抑菌肽。分為以下六個亞類:

1.2.1 IIa類乳酸菌細菌素 IIa類乳酸菌細菌素一般由37～48個氨基酸殘基組成,這些氨基酸殘基具有β-折疊片構型、帶正電荷、高保守的親水性N端和一到兩個低保守的兩親性或疏水性α-螺旋的C-末端。IIa類細菌素等電點一般較高,存在親水性N-末端,通過ABC運輸轉運共有序列Tyr-Gly-Asn-Gly-Val-Xaa-Cys[YGNGV(X)C(X)C(X)V(X)A]的系統[15-16];IIa類乳酸菌細菌素對李斯特菌(Listeriaspp.)有較強的抑制活性,因此IIa類乳酸菌細菌素在乳制品中具有很大的應用價值[28-31]。

1.2.2 IIb類乳酸菌細菌素 IIb類乳酸菌細菌素(雙肽細菌素)是由兩種不同的氨基酸肽類寡聚體形成,可以進一步細分為E-型和S-型兩個類型。E-型是功能增強型,即每個多肽都有活性,但抑菌活性會隨著另一個多肽的存在而增強,代表性的是Lactacin F[17];S-型是功能協同型,此類乳酸菌細菌素的活性依賴于兩個肽鏈。即任何一個肽鏈單獨作用時無活性,只有兩個肽鏈協同作用下才有抑菌活性,此類細菌素的代表為Lcn G[18]。

1.2.3 IIc類乳酸菌細菌素 IIc類乳酸菌細菌素是由前導肽帶出胞外、具有熱穩定的環形抑菌肽[19],與其他線性結構的乳酸菌細菌素相比,IIc類乳酸菌細菌素結構更穩定、耐熱效力更高、對蛋白水解消化更穩定,抑菌譜更廣。此類細菌素可以進一步分成兩類:硫醇類和胱氨酸類細菌素。硫醇類細菌素具有兩個半胱氨酸殘基,而胱氨酸類細菌素只有一個半胱氨酸殘基[19]。

1.2.4 IId、IIe和IIf類乳酸菌細菌素 IId類乳酸菌細菌素是沒有合成N-末端前導序列或信號肽的一類細菌素,和其他II類的主要區別就在于此[12]。IIe類乳酸菌細菌素是由三種及以上不同的氨基酸肽類組成的多肽類細菌素,由較大的蛋白特異性降解形成的,如Aureocin A70[21]和Garvicin KS[22]。IIf類是熱穩定性強的其他II類乳酸菌細菌素,這類細菌素主要由單鏈非類片球菌或其他細菌素的組合而成的,無相似序列。

1.3 III類乳酸菌細菌素

III類乳酸菌細菌素是由高分子量(>30 kDa)、熱穩定性差的一類抑菌肽組成。這類細菌素可進一步分為兩個亞類,其中IIIa類是溶菌性細菌素;IIIb類是非溶菌性細菌素[23-24]。IIIa類通常以酶切的方式裂解細菌的細胞壁,從而達到抑菌的目的。

1.4 IV類乳酸菌細菌素

IV類乳酸菌細菌素是一種帶正電荷的疏水性大分子,與其他大分子形成大復合物的抑菌肽[24]。由于現有提純手段的局限,未能將細菌素與復合大分子完全分離,所以把這類細菌素暫歸為IV類細菌素。近年來,通過分離方法和全基因組測序技術結合,將一些原本屬于IV類細菌素重新進行了劃分,如植物乳桿菌素S(Plantaricin S)就是通過提純后重新將其劃歸于IIb類的典型代表。

2 乳酸菌細菌素對革蘭氏陽性菌抑菌機制

由于細菌素對革蘭氏陽性菌有高效的抑制作用,而對革蘭氏陰性菌、霉菌等可能無抑菌作用或效果不明顯,因此大多數抑菌機理研究主要針對的是革蘭氏陽性菌[32-33]。相關研究表明,乳酸菌細菌素主要通過與細胞膜受體特異性結合,促進細菌素在目標細菌的細胞膜上形成“核結構”,從而破壞細胞膜的完整性,造成目標細菌的質子動力的消散,從而導致目標細胞死亡[34-36]。

2.1 I類乳酸菌細菌素抑菌機制

I類乳酸菌細菌素的作用機制主要分為a、b兩類。Ia類羊毛硫類細菌素是通過連接細胞膜上受體(lipid II),形成短暫的、非選擇性跨膜孔通道,對質子動力產生干擾,從而影響氨基酸的轉運,造成細胞內小分子流失[37]。目前Ia類細菌素中研究最透徹、應用最廣泛的是nisin[38]。相關研究表明,nisin作用機制依賴于作用濃度:nisin濃度低時,通過抑制細胞壁合成起作用;nisin濃度高時,通過形成孔通道起作用[39]。Ib類細菌素基于它們的剛性和球狀結構,通過靜電吸引與細胞膜結合和/或通過與膜相關組分(lipid II)的特異性結合來抑制DNA/RNA/蛋白質或細胞膜合成[37-38]。

2.2 II類乳酸菌細菌素抑菌機制

2.2.1 IIa類乳酸菌細菌素 IIa類乳酸菌細菌素的N-端的保守序列YGNGVXXXC作為發夾結構，可被細胞膜上的蛋白受體特異識別,其帶正電荷的親水結構與目標細菌細胞膜上帶負電的磷脂極性殘基以靜電力形式相結合,然后疏水性強的C-端與膜脂酰基作用,插入到膜內疏水區,聚集形成“核結構”[40-42]。“核結構”導致細胞內各種離子的滲漏,引起了膜內外離子失衡和磷酸鹽的滲漏,從而導致細胞的死亡[43]。由此可見,C-末端是IIa類細菌素目標細胞特異性的決定區[44-45]。Diep等[46]研究發現IIa類乳酸菌細菌素主要是以目標細菌細胞膜上的man-PTS為作用受體。這個系統屬于磷酸轉移酶系統,主要負責糖的運輸和磷酸化。man-PTS作為對接分子,導致細胞膜的通透性增加,質子動力的破壞和ATP的消耗,從而導致微生物細胞生物合成的停止。

2.2.2 IIb類乳酸菌細菌素 IIb類乳酸菌細菌素中E-型屬于功能增強型。它的抑菌機制是通過連接lipid II受體,使膜通透性增加,細胞內的離子流失,質子動力勢的耗散,但其活性不僅僅取決于質子動力勢的耗散,還與ATP的多少有關。由于胞內磷酸鹽的流失打破了ATP的電解平衡,致使可用的ATP的降低;而S-型是功能協同性,Kjos等[47]通過全基因組測序技術鑒定出S-型細菌素(Lcn G)的受體為UppP。UppP是一種高度保守的跨膜蛋白,能特異性地靶向乳酸乳球菌。細菌素在與UppP識別之后,細胞內的K+被釋放,ATP水平降低。這表明細胞內K+的選擇性流失造成質子動力勢能的消耗,對依賴于ATP的反應造成了影響,從而抑制微生物生長繁殖[47]。

2.2.3 IIc、IId類乳酸菌細菌素 Gabrielsen等[48]研究發現乳酸乳球菌中的麥芽糖ABC轉運蛋白是IIc類乳酸菌細菌素Garvicin ML的受體。IIc類乳酸菌細菌素作用方式也是通過與細胞膜上的特異性受體結合,增加膜滲透性,從而引起細胞內離子流失、膜電位的耗散,最終導致細胞死亡。IId類乳酸菌細菌素是沒有合成N-末端前導序列或信號肽的一類細菌素。Uzelac等[49]發現Zn-依賴型金屬肽酶對IId類乳酸菌細菌素(Lsb B)敏感。但LsbB與其他已知的IId類乳酸菌細菌素存在一定的差異,所以目前尚不清楚其他IId類乳酸菌細菌素對微生物的抑制機理。

2.3 III類乳酸菌細菌素抑菌機制

目前,III類乳酸菌細菌素發現的不多,它們的作用機制研究得也不透徹。相關研究顯示[22],IIIa類乳酸菌細菌素可能是肽鏈內切酶肽,或者是其N-末端部分與參與細胞壁合成的內肽酶同源,C-末端部分負責識別靶細胞,通過酶促反應裂解目標細菌細胞壁,從而殺死細菌;IIIb類乳酸菌細菌素通過與磷酸烯醇丙酮酸依賴性葡萄糖和man-PTS系統結合而干擾葡萄糖轉運或代謝,從而達到抑菌效果。

2.4 IV類乳酸菌細菌素抑菌機制

現在有關IV類乳酸菌細菌素抑菌機制研究較少,但這一類細菌素作用方式可能與I類、II類大多數細菌素類似,通過改變敏感細胞細胞膜的通透性,致使膜電位的消散、離子泄露,從而導致細胞死亡[50]。

3 乳酸菌細菌素在水產養殖及加工的應用

3.1 乳酸菌細菌素在水產養殖中的應用

乳酸菌細菌素在水產養殖中的應用主要是改良水質[51-53]。目前,水產養殖中抗生素的濫用已導致水體的微生態失衡,容易引起各種病害產生,促進部分有害微生物產生抗藥性,這些都不利于水產養殖[54]。乳酸菌細菌素作為無毒、高效、無體內殘留的抑菌物質,抑菌具有特異性,所以根據具體需要選用特定乳酸菌細菌素,可以避免引起養殖環境的微生態失衡[37]。李南充[55]在池塘養殖中直接加入乳酸菌細菌素或分泌細菌素的乳酸菌作為微生態制劑,發現這些微生態制劑不僅能明顯改善水質狀況,而且可以改善魚腸道菌群結構,提高飼料吸收率。

在養殖魚蝦中主要是通過添加乳酸菌細菌素到飼料中來飼養魚蝦等水生動物[5,53-55]。主要作用在兩方面[56]:一是對動物體內的致病微生物生長繁殖產生抑制,從而使其免疫能力提高,抗病能力加強;二是抑制飼料中有害微生物的生長繁殖。研究表明,乳酸菌細菌素添加到飼料中,能有效地抑制致病微生物生長,同時提高魚類等動物的免疫力,減少疾病的發生[56-59]。Taoka等[60]將高濃度的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)和丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)4種菌摻入飼料喂養比目魚,結果表明比目魚的黏膜蛋白水平降低,溶菌酶活性顯著提高,在被鰻弧菌感染后,飼喂混合飼料的比目魚其存活率也得到了相應提高。這些研究表明,使用乳酸菌細菌素或者添加產細菌素的乳酸菌菌株,對維持養殖水體環境微生態平衡以及提高水產動物免疫力有一定的幫助。但目前乳酸菌細菌素的添加劑量及安全性仍處于研究階段,這也限制了添加乳酸菌細菌素飼料的大批量生產,因此這還需要進一步研究以提供理論支持。

3.2 乳酸菌細菌素在水產品儲藏的應用

在水產品儲藏方面,眾多研究表明乳酸菌細菌素對致病菌有一定的抑制作用,并且對水產品的感官品質、貨架期延長等方面都有一定的改善作用[61-66]。Sudalayandi[67]通過在印度鯖魚上接種不同的乳酸菌菌株(戊酸片球菌、嗜熱鏈球菌、乳酸乳球菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌和瑞士乳桿菌),這些菌株能有效控制腐敗菌和有機胺類產生,且在37 ℃貯藏條件下,延長了新鮮魚貨架期2 d。Kalschne等[68]利用2.0%乳酸與nisin應用于冷凍蝦,發現能有效減少儲存期間產品中的假單胞菌屬(Pseudomonasspp.)以及產硫化氫的細菌。Katikou等[69]研究發現,在真空包裝的虹鱒魚片中添加能產抑菌物質的清酒乳桿菌 CECT 4808,儲存在(4±0.5) ℃條件下20 d,處理后的虹鱒魚片中常見微生物(腸桿菌、假單胞菌、產H2S細菌、酵母菌和霉菌)含量顯著降低;氣味以及化學指標(pH、揮發性總氮和脂質氧化)得到明顯改善,接種了清酒乳桿菌的樣品表現出良好的防腐能力,可延長保質期5 d,還表現出一定的抗氧化能力。Hwanhlem等[70]在8 ℃條件下,將分離純化的乳酸菌素KT2W2L應用于氣調包裝的去皮熟制熱帶蝦中,實驗發現,乳酸菌素KT2W2L對24種食物腐敗菌和食源性致病菌中的23種指示菌有高效的抑制作用;定期監測接種了該細菌素的蝦制品在8 ℃儲存條件下細菌的生長,結果發現7 d后,乳酸菌素KT2W2L仍能抑制熱殺死環絲素(B.thermosphacta)和無害李斯特菌(L.innocua)的生長。

這些研究表明,將乳酸菌細菌素或產細菌素的乳酸菌作為生物防腐劑添加到水產制品中,可以有效提高產品安全性并延長貨架期,同時抑制水產品中生物胺、氨和三甲胺氧化物的產生[71]。乳酸菌細菌素作為生物防腐劑有較大的發展空間,結合一些傳統抑菌方法、柵欄技術和分子技術,能大大提高其應用價值,這為開發微量加工和無防腐劑的水產制品提供了方向。

4 結論與展望

本文通過介紹不同乳酸菌細菌素的現有研究成果,突出說明大部分乳酸菌細菌素的應用價值,相關研究結果表明使用提取的細菌素或產細菌素的乳酸菌在水產品中能夠產生明顯的抑菌效果,有很高的應用價值[72]。然而目前只有nisin被認可在食品中使用,這也說明乳酸菌細菌素的發展還需要更多的研究數據作為支撐(比如抑菌機理、細菌素毒力試驗等),從而最大層面地發揮乳酸菌細菌素的價值。同時,在已研究的乳酸菌細菌素中,大部分乳酸菌細菌素的抑菌譜不如nisin廣。這也意味著更多廣譜乳酸菌細菌素需要得到篩選和分離。本文最后又重點介紹了乳酸菌細菌素的抑菌機理及其在水產品養殖、加工領域的研究趨勢。這些研究結果也充分說明乳酸菌細菌素可以作為抗生素等藥物替代品應用于水產品養殖、加工等領域。

隨著抗生素及激素類等藥物的大量使用,抗藥性微生物的不斷發現,這已成為養殖行業一個日益嚴峻的問題。乳酸菌細菌素作為一種新型、高效、綠色、安全的生物抑菌劑,在水產方面的應用具有廣闊前景,但其在水產方面的應用還需解決的問題主要有:

a.乳酸菌細菌素應用的最佳條件:由于不同的乳酸菌細菌素在不同環境(pH、接種濃度、培養時間和營養來源等)下表現不同,而環境因素決定了其抑菌效果,所以更準確地了解特定乳酸菌細菌素最佳應用條件對其發展有促進作用;

b.在水產制品保鮮方面,乳酸菌細菌素結合其他技術(如超聲輻照、微波加熱及柵欄技術)協同效應尚未得到完全開發,因此乳酸菌細菌素與食品生態系統的相互作用也需進一步研究;

c.乳酸菌細菌素在由微生物引起的水產病害防治方面的研究比較少,這也是今后發展的一個方向。同時,需要注意的是,由于現有技術條件制約,乳酸菌細菌素產量較低、表達不夠穩定、提取成本高、作用機理研究不夠透徹等因素一定程度上限制了乳酸菌細菌素的應用。然而,隨著科學技術的進步和對乳酸菌細菌素研究的深入,這種綠色安全、天然高效的抑菌劑將有廣闊的市場前景,也將為水產領域發展提供更多的選擇空間。