二氧化鋯QuEChERS-高效液相 色譜-串聯質譜測定魚肉中 2種硝基咪唑及代謝產物

(福建省食品藥品質量檢驗研究院,福建福州 350000)

硝基咪唑類藥物是一類5位被硝基取代的雜環化合物,主要包括甲硝唑、地美硝唑、洛硝噠唑、替硝唑等[1]。該類藥物有抗菌和抗原蟲作用,并具有成本低、療效快的特點,被廣泛應用于水產品養殖中寄生蟲的防治與感染。研究表明,該類藥物及其代謝產物具有潛在的致癌、致病變及損傷DNA的作用[2],因此,我國對于硝基咪唑類藥物在動物源性食品養殖及生產過程中的應用進行了嚴格的控制[3-4]。

目前,測定硝基咪唑類抗生素及其代謝物的方法主要有氣相色譜法[5]、氣相色譜質譜聯用法[6]、高效液相色譜法[7]和高效液相色譜質譜聯用法[8]等。由于液相色譜法的檢出限較高,基質干擾較大,難于定量;氣相色譜法及氣相色譜質譜聯用法抗干擾能力較弱,適用范圍相對較窄;而液相色譜質譜聯用法同時具有較低的檢出限、較高的抗干擾能力及適用范圍廣等特點,被廣泛應用于硝基咪唑及其代謝產物的檢測。我國現行有效的動物源性食品及飼料[9]中硝基咪唑及其代謝物檢測標準中檢測方法主要是液相色譜串聯質譜法,故而本文選取該方法為檢測方法。

硝基咪唑及其代謝產物殘留檢測常用到的前處理方法有液液萃取[10]、固相萃取[11]和QuEChERS[12]等。QuEChERS技術因高效、快速、成本低等特點,被廣泛地應用于農獸藥殘留檢測領域[13]。常規用于獸藥檢測前處理的QuEChERS試劑成分主要是十八烷基鍵合硅膠吸附劑、N-丙基乙二胺吸附劑和無水硫酸鎂,可滿足大部分動物源性食品中獸藥殘留的檢測,但是對于磷脂含量較高的食品,經QuEChERS試劑包處理后,仍會出現基質干擾,導致靈敏度和測量準確性降低。鋯離子或鋯氧化物與磷酸根或基團具有強的配位作用,Xiangyang等[14]利用UIO-67中的鋯氧簇中的鋯來吸附水樣中的草甘膦和草胺磷,彭西甜等[15]、姚凱等[16]利用該機理用納米級的二氧化鋯吸附脂類及磷脂。本文同樣基于該機理,在QuEChERS試劑中加入二氧化鋯顆粒用于吸附磷脂來降低基質干擾,同時參考已有的研究和標準,擬建立改進的QuEChERS方法結合HPLC-MS/MS來測定動物源性食品中的硝基咪唑類藥物,并以魚肉為代表性基質,以兩種硝基咪唑藥物和一種代謝產物為目標獸藥,并對實驗條件及QuEChERS試劑量進行優化,以期滿足魚肉中硝基咪唑及其代謝產物殘留的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲硝唑(Metronidazole,MNZ) 中國食品藥品檢定研究院;羥甲基甲硝咪唑(2-hydroxymethyl-1-methyl-5-nitroimidazole,HMMNI) 德國WITEGA公司;地美硝唑(Dimetridazole,DMZ) Dr. Ehrenstorfer公司;乙酸乙酯、乙腈色譜純 美國TEDIA公司;乙酸銨、氨水、甲酸 色譜純,上海阿拉丁公司;二氧化鋯(粒徑200～400 nm) 美國Sigma公司;十八烷基鍵合硅膠吸附劑(C18)、N-丙基乙二胺吸附劑(PSA)、無水硫酸鎂 博納艾潔爾公司;超純水 由Milli Q系統制得,美國Milipore公司;實驗所用的魚肉 均為市售的鮮活海鱸魚,宰殺后取可食用部分搗碎所得。

API5500型四極桿串聯質譜儀配電子噴霧離子源 美國AB公司;Agilent 1290型超高效液相色譜儀 美國Agilent公司;Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.8 μm) 美國Agilent公司;Hei-VAP Precision減壓旋轉蒸發儀 德國Heidolph公司;CR21N高速冷凍離心機 日本HITACHI公司;SW22恒溫水浴振蕩器 丹麥FOSS公司;VORTEX 4 digital渦旋混合器 德國IKA公司;HM100刀式研磨儀 北京格瑞德曼公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準工作溶液和緩沖液的配制 準確稱取各硝基咪唑標準物質10.0 mg,用甲醇溶解并定容至10.0 mL,配得濃度為1.0 mg/mL的單標溶液;準確吸取上述各單標溶液適當體積于100.0 mL容量瓶中,用甲醇定容配得濃度為1000 ng/mL的三種物質混標標準中間溶液;于4 ℃下避光保存。稱取乙酸銨14.4 g用9000 mL水溶解,再用氫氧化鈉溶液調節pH至5.2,然后定容至1000.0 mL混勻后得乙酸緩沖液。

1.2.2 液相色譜與質譜條件 Agilent Eclipse Pluse C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.8 μm)。流動相:0.1%甲酸水(A)-0.1%甲酸乙腈(B);梯度洗脫程序:0～3.0 min,95%～5% A;3.0～5.0 min,5%～5%;5.0～5.1 min,5%～95%;5.1～7.0 min,95%～95%;柱溫:30 ℃;流速:0.25 mL/min;進樣量:1.0 μL。本實驗著重考察了0.1%甲酸水-甲醇、0.1%甲酸水-乙腈、0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇、0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈做為流動相時,對各物質的峰型及分離效果的影響。

電子噴霧離子源(ESI),正離子掃描,多反應監測掃描模式(MRM);離子源溫度:450 ℃;電噴霧電壓:4500 V;氣簾氣壓:30 Psi;霧化氣壓:55.0 Psi;輔助氣壓力:55.0 Psi;碰撞室入口電壓:10 V;碰撞室出口電壓:15 V。

在優化質譜條件時,采用直接進樣的方式,分別將50 μg/L的單標液注入離子源,在ESI正離子模式下,獲得準分子離子峰。參考歐盟2002/657/EC的規定,以準分子離子峰為母離子,選擇響應值較高的兩個碎片作為子離子,和母離子組成離子對,同時分別優化各離子對的碰撞能量、去簇電壓、碰撞室出口及入口電壓。為保證三種硝基咪唑的檢測靈敏度和準確度,本文采用多反應監控模式(MRM),見表1。

表1 3種硝基咪唑類的多反應監測掃描模式下的質譜參數Table 1 Mass spectrometric conditions (MRM)of three nitromidazoles

1.2.3 樣品前處理方法及優化 魚肉樣品的制備:取魚的可食部分,刀式研磨儀以8000 r/min 的速度,2 min充分搗碎混合均勻后,分裝入潔凈的聚四氟乙烯材質的小瓶中,密封,并于-18 ℃以下冷凍存放,每次使用前取一份分裝樣品,常溫充分解凍,待回溫至室溫后稱取,且每份分裝樣品解凍稱取后即棄去。

稱取2.00 g魚肉于50 mL離心管中,加入8 mL乙酸銨緩沖液,渦旋混勻,室溫靜置,加入15 mL提取溶劑、5.0 g無水硫酸鈉,高速渦旋混勻后,放于室溫水平振蕩器中,振蕩提取10 min,在4 ℃條件下,以9500 r/min的高速離心5 min,取上清液;殘渣重復提取一次后,合并兩次提取液,待凈化。向提取液中加入凈化劑(100 mg PSA、40 mg C18、600 mg無水硫酸鎂及一定量的二氧化鋯),高速渦旋1 min混勻,在4 ℃條件下,以9500 r/min的高速離心5 min,吸取全部有機相,40 ℃下在減壓旋轉蒸發儀上蒸發至近干,精密加入1 mL 0.1%甲酸水-乙腈(95∶5,體積比),渦旋溶解殘渣,過0.22 μm濾膜,待上機。

1.2.3.1 提取溶劑的選擇 按照1.2.2儀器條件及1.2.3提取過程,考察不同提取溶劑對樣品中硝基咪唑的提取效率,本文比較1%氨水-乙腈、1%氨水-甲醇、1%氨水-乙酸乙酯的提取效率,在其他實驗條件不變的前提下,提取效率是通過加入相同量(3 μg/kg)標準溶液,不同提取溶劑的回收率高低來確定。

1.2.3.2 二氧化鋯加入量的確定 考察不同加入量的二氧化鋯,對樣品基質凈化效果的影響。在本文中,C18、PSA和無水硫酸鎂的量參照SN/T 3235-2012中的量[17]加入,對二氧化鋯的量(0、10、20、40、60、80、100 mg)進行優化。通過比較在加入相同加標量時(3 μg/kg),三種硝基咪唑峰面積的大小,確定最佳的二氧化鋯加入量。

1.2.4 基質效應計算 基質效應是質譜檢測過程中影響方法靈敏度、精密度及準確度的主要因素之一[18]。本文采用相對響應值法來評價三種硝基咪唑類的基質效應:

式(1)

式中:Ay為基質配標響應值,A0為溶劑配標響應值。當基質效應的為正值時,表現為基質增強效應;當基質效應為負值時,表現為基質抑制效應;基質效應的絕對值越大,基質效應越強。通常認為,基質效應的絕對值小于20%時,可以認為基質干擾對結果的影響不大,但當其絕對值大于20%時,基質效應不可忽略。

1.2.5 標準曲線、檢出限及定量限 按照1.2.3步驟處理空白樣品得空白基質溶液,取適量的標準中間溶液,以空白基質溶液定容至質量溶度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 ng/mL的標準工作溶液。按照1.2.2的條件進樣,以質量溶度為橫坐標,以分析物的峰面積為縱坐標,繪制標準曲線。方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)是通過空白樣品加入不同濃度的標準工作溶液的方法測定的,其中當信噪比RS/N≥3.0時的含量為檢出限,RS/N≥10.0時的含量為定量限。

1.2.6 回收率及精密度實驗 取空白魚肉樣品,三種硝基咪唑的添加濃度依次為:MNZ 0.2、0.4、1.0 μg/kg,DMZ 0.2、0.4、1.0 μg/kg,HMMNI 0.5、1.0、2.5μg/kg三個水平標液,每個濃度平行6次試驗,前處理方法參照1.2.3,儀器條件參照1.2.2,進行檢測,計算回收率和相對標準偏差。

1.3 數據處理

采用Analyst及MultiQuantTM軟件進行分析,采用Origin 8.0作圖。

2 結果與分析

2.1 色譜及質譜條件的優化

在正離子模式條件下,甲酸的加入可以增大離子化效率[17],同時參考了文獻及現有的國家標準,甲酸的含量在0.1%時,結果最優。所以本實驗著重考察了0.1%甲酸水-甲醇、0.1%甲酸水-乙腈、0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇、0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈做為流動相時各物質的分離效果。對比各流動相的標液譜圖,發現以0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈作為流動相時,分離效果最佳,峰型較好無拖尾現象,故在本文中選用0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈作為流動相,三種化合物的總離子流圖見圖1。

圖1 3種硝基咪唑類藥物的定量離子流圖Fig.1 MRM chromatograms of quantitative ion pairs for 3 nitromidazoles注:A、B、C依次為DMZ、HMMNI、MNZ。

2.2 提取溶劑的優化

在檢測硝基咪唑類藥物時,常被用到的提取劑主要有乙腈[12,19-21]、乙酸乙酯[22]、甲醇[23]及一些混合試劑。硝基咪唑類藥物是酸堿兩性化合物,在弱酸性條件下可以質子化,在弱堿性條件下則以游離分子形式存在,據文獻[12]報道,DMZ、MNZ兩種對提取溶劑的pH要求不高,但是HMMNI的提取效率在中性或者酸性條件下較低,故本文在提取劑中加入了氨水。如圖2所示,1%氨水-甲醇的提取效率最低;1%氨水-乙酸乙酯的提取效率最高,且在旋蒸過程中所需的溫度低,時間短;1%氨水-乙腈提取效率相對較高,同時乙腈可以有效地沉淀動物源性食品中的蛋白質,且脂肪提取率低,故而基質影響最小。綜合考慮后,最后選擇1%氨水-乙腈作為提取劑。

圖2 提取劑對硝基咪唑類藥物提取回收率的影響Fig.2 Effects of different solvent combination on the recovery rate of three nitromidazoles

2.3 二氧化鋯加入量的優化

在獸藥殘留量分析的過程中,分散固相萃取法常用到的凈化吸附劑有C18、PSA和無水硫酸鎂三種,可以高效地去除樣液中的脂肪、色素、金屬離子和有機酸等,但是動物源性產品中磷脂含量較高,且磷脂對實驗結果有一定的影響,常用的C18和PSA對磷脂的去除效率不高,加大C18和PSA的量會降低一部分獸藥的回收率。利用磷酸基團與鋯的強配位作用,在凈化劑中加入二氧化鋯微球,可高效除去提取液中的磷脂,這樣既可以避免因加入過量C18和PSA降低回收率,同時又可消除磷脂帶來的基質影響。結果如圖3所示,加入二氧化鋯后,三種化合物的峰面積有了明顯的提高,說明二氧化鋯的加入有效吸附了基質中的磷脂,減小了基質抑制效應帶來的影響。隨著二氧化鋯加入量的增大,三種化合物的峰面積基本維持不變,因為所稱取的魚肉質量有限,提取出的磷脂量有限,10 mg二氧化鋯足以吸附提取液中的磷脂,同時考慮到各實驗樣品磷脂含量的差異性問題及實驗成本,最終確定二氧化鋯吸附劑的用量為20 mg。

圖3 二氧化鋯加入量對峰面積的影響Fig.3 Effects of different ZrO2 addition on the peak area of three nitromidazoles

2.4 基質效應

由圖4可見,MNZ、HMMNI、DMZ的基質效應分別為-34.8%、-28.4%、-34.7%,三種化合物的基質效應均為負值,且絕對值均大于20%,說明基質對三種化合物存在明顯的抑制作用,原因可能為,前處理過程中,魚肉中的可溶性蛋白、多肽等內源性物質隨目標物共同流出,在質譜分析電離過程中這些共同流出物抑制了目標物的離子化。由于無法獲得與檢測化合物一一對應的同位素內標物,因此本文采用更為常見的基質配標準曲線定量的方法,來降低基質效應的影響。

圖4 三中硝基咪唑的基質效應Fig.4 Matrix effects of the three nitromidazoles

2.5 線性方程、檢出限和定量限

如表2所示,三種化合物的在0.5～20 ng/mL范圍內線性關系良好,R2均大于0.998;MNZ和DMZ的檢出限為0.2 μg/kg,HMMNI的檢出限為0.5 μg/kg,MNZ和DMZ的定量限為 0.6 μg/kg,HMMNI的定量限為1.2 μg/kg。

表2 三種硝基咪唑的線性方程、線性范圍、檢出限、定量限Table 2 Linear equations linear relationships,LODs,LOQs of three nitromidazoles

2.6 回收率和精密度

如表3所示,三種硝基咪唑在三個加標水平下的回收率在88.1%～107.0%之間,相對標準偏差在2.43～8.17%之間。方法具有較高的準確度和精密度,符合實際檢測要求。

表3 三種硝基咪唑的加標回收率及相對標準偏差(n=6)Table 3 Recoveries and relative standard deviations of three nitromidazoles(n=6)

2.7 市售樣品檢測

按照優化后的處理方法及色譜條件,對本地不同超市市售的50批次魚樣品進行DMZ、HMMNI及MNZ的檢測。實驗結果顯示,只有1批次的鰻魚檢出MNZ,其含量為0.7 μg/kg,其余產品均未檢出這三種硝基咪唑類藥物。

3 結論

本文針對動物源性產品中磷脂含量高的基質特點,結合已有的研究及行業標準,通過加入二氧化鋯,改進了傳統的QuEChERs方法以消除魚肉樣品中磷脂帶來的基質干擾,并優化儀器分析參數、樣品前處理及二氧化鋯加入量。與傳統的QuEChERs相比,分析方法的選擇性及靈密度有所提高,其檢出限在0.2～0.5 μg/kg之間,定量限為0.6～1.2 μg/kg之間;平均回收率在88.1%～107.0% 范圍內,相對標準偏差在 2.43%～8.17%范圍內。該方法具有準確、高效、靈敏度高的優點,適用于魚肉中DMZ、HMMNI及MNZ的快速檢測和日常篩查。雖然本文只選取了兩種硝基咪唑及一種其代謝產物作為目標分析物,但文中的前處理方法可能適用于具有相似分子結構的其他類硝基咪唑類藥物,乃至其他獸殘類藥物的檢測。