食源性混合菌生物被膜的 形成和相互作用機制

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(1.內蒙古農業大學食品科學與工程學院,內蒙古呼和浩特 010018; 2.內蒙古農業大學職業技術學院,內蒙古包頭 014109)

近幾年來,食源性疾病引起的食物中毒事件不斷發生,食品安全問題受到了國內外廣泛關注。據世界衛生組織(WHO)報道,每年食源性疾病高達30%。這些由病原菌引起的食品安全問題中,65%是因為病原菌形成生物被膜造成的[1]。細菌生物被膜(biofilm)是菌體為適應脅迫環境,粘附于物體或者人體組織表面,通過分泌大量的多糖、蛋白質和核酸等胞外基質將自身包裹在其中而形成的聚集膜樣物[2]。生物被膜會形成牙菌斑等危及人類健康,還會對食品加工設備、加工廠地板和墻壁表面造成污染[3]。相較于單個的浮游細菌,生物被膜的形成會對抗生素和宿主免疫系統產生更強的抵抗力。因此,生物被膜形成機制的研究一直是國內外學者關注的重點領域[4]。

細菌生物被膜的研究一直集中于醫學領域中,直到1988年Dodd等[5]從雞肉加工廠的脫毛器械中發現了金黃色葡萄球菌生物被膜,并發現它們對抗菌劑有較強抵抗力,至此食源性病原菌生物被膜會造成食品腐敗的問題被廣泛關注。Herald等[6]使用掃描電子顯微鏡(SEM)研究了單核細胞增多性李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)于10、21、35 ℃下在不銹鋼表面的附著程度,發現微生物細胞在三個溫度下均可粘附,又進一步發現食品的加工地板、輸送管道上極易形成單核細胞增多性李斯特氏菌生物被膜,給食品加工安全造成巨大隱患。Giaouris等[7]發現,在肉類加工過程中,潛在的致病菌會粘附在食物接觸表面形成生物被膜,從而導致產品發生交叉污染、保質期降低等問題。隨著不斷的研究發現,不僅革蘭氏陽性菌會形成生物被膜,大腸桿菌(Escherichiacoli)、沙門氏菌(Salmonella)、單核細胞增多性李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)等食源性革蘭氏陰性菌也會形成生物被膜。

食品加工環境中,病原菌的持續存在是造成食源性疾病發生的主要因素,并被認為對公共健康有重大影響。食品加工環境會為生物被膜的形成提供有利條件,例如水分、營養物質等。在這樣的有利條件下,細菌可以粘附于食品接觸表面繁殖并形成生物被膜,從而危及食品的質量和安全性[8]。目前,研究人員主要致力于單一菌種生物被膜的形成特性及抑制清除生物被膜方法的研究,對混合病原菌生物被膜的研究較少。但存在于自然界中的大多是多種病原菌形成的混合病原菌生物被膜,其結構成分更為復雜,抵抗外界不良環境能力加強,一旦達到成熟期很難被完全清除。因此,研究混合病原菌生物被膜的形成特性和菌間相互作用機制至關重要。

本文在現有的研究基礎上,歸納總結了食源性混合菌生物被膜的形成規律及混合菌生物膜中菌種間的相互作用,初步探討了群體感應在混合菌生物膜中的作用,以期為食品領域應對和破解食源性混合菌生物被膜污染問題提供啟示。

1 生物被膜的形成

生物被膜的形成是一個動態且非常迅速的過程。與同種微生物的浮游狀態相比,生物被膜的形成過程是十分復雜的。此過程會產生物理、化學、生物反應,細胞間會通過特殊類型的信號傳遞以及不同組基因的轉錄進行聯系[9]。遺傳學研究表明,形成混合菌生物被膜會經過五個階段:第一階段是細菌表面的特異性蛋白等物質選擇性的粘附于物體表面而發生的可逆粘附,處于粘附期的細菌狀態不穩定,因此可在此階段及時進行清除[10]。第二階段是細菌通過自身分泌的胞外聚合物或鞭毛介導而發生的不可逆粘附,通過靜電作用產生的附著力不僅將微生物細胞附著于生物材料表面,還會加強生物膜內微生物細胞間的凝聚力[11]。第三階段是發展期,通過胞外多糖內的特定化學信號分子,細菌群落不斷聚集,使得生物被膜不斷加厚,生物被膜中的細菌菌落通常是由多種類型的微生物群落組成的混合生物被膜,混合生物被膜的形成為不同微生物的相互依賴生長提供了良好環境[12]。第四階段的微生物間會通過自體誘導物信號進行交流,并分泌大量胞外多聚糖,以形成高度有組織的成熟生物被膜,此階段的生物被膜已達到穩定狀態,對外界抵抗力達到最強,且最難以被清除[13]。第五階段是混合生物被膜內的一部分微生物開始脫落,在脫落過程中,生物膜內的微生物會產生不同的糖分解酶,以幫助被釋放的微生物重新粘附于物體表面形成新的生物被膜[14]。通過這五個階段,微生物在混合生物被膜內完成了粘附、發展、成熟、脫落、重新粘附的循環過程。

2 生物膜內菌種間的相互作用

食品加工環境中的微生物種類繁多,且均可以在固體表面形成生物被膜。這種多樣性使得它們之間以不同的相互作用關系構成了復雜的混合菌生物被膜。越來越多的研究表明,多物種生物被膜對抗生素的抵抗力要明顯高于單一種類的抵抗力[21]。Van等[22]研究發現,單核細胞增多性李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)和植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)形成的混合生物被膜對苯扎氯銨和過乙酸的抗性要明顯強于其單一菌的耐藥性。因此,研究混合菌生物被膜形成特性及其種間相互作用關系尤為重要。根據學者們的研究可知,在食源性混合病原菌生物被膜中,菌種間的主要相互作用是共生和競爭。

2.1 共生作用

共生又叫互利共生,是多種生物相互分工合作,缺此失彼都不能生存的一類種間關系[23]。混合菌生物膜中的微生物間也存在共生作用,這種種間的相互促進作用會增強細菌對固體表面的附著力。Wang等[24]對食源性病原菌腸道沙門氏菌(Salmonellaenterica)、血清型鼠傷寒沙門氏菌(SalmonellaentericaserovarTyphimurium)和產志賀毒素大腸桿菌(Shigatoxin-producingEscherichiacoli)O157∶H7形成的單種生物膜及其混合菌生物被膜進行研究發現,一是細菌生物被膜比浮游菌對消毒作用的抵抗力更強;二是具有負胞外多糖表達的沙門氏菌和大腸桿菌菌株形成的混合病原菌生物被膜比單菌株生物膜更具耐藥性,表明細菌間的互利共生作用加強了生物膜的抵抗力。Zhang等[25]發現了銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的生長可以保證黃桿菌(Flavobacterium)進入混合菌生物被膜有利區域。Ibusquiza等[26]通過對不同情況下單核細胞增多性李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)和惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)形成的混合菌種生物膜與相應的單菌種生物膜微觀結構進行比較得出,惡臭假單胞菌與單核細胞增多性李斯特氏菌的關聯關系加速了生物被膜的形成。Kai等[27]通過熒光標記法發現,銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)形成的雙菌種生物被膜與單種生物被膜空間結構和豐富度都不同。混合雙菌種生物被膜對抗菌劑(十二烷基硫酸鈉、抗壞血酸)均比單一菌種抵抗力強。至關重要的發現是,雙菌種間的互利共生作用對生物被膜起到了保護作用,而不是某一單一菌的選擇性抵抗力發揮作用。Sancbhezvizuete等[28]研究發現,枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)能夠保護金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)不受殺菌劑作用。在此雙菌種生物膜中,枯草芽孢桿菌中的ypqP基因會增強生物被膜對殺菌劑的耐受性,以起到保護金黃色葡萄球菌的作用。Ren等[29]研究發現,嗜根寡養單胞菌(Stenotrophomonasrhizophila)、黃單胞菌(Xanthomonas)、氧化微桿菌(Microbacteriumoxydans)和解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)四種菌在混合生物被膜中表現出超強的協調作用。在特定的體外環境中,只有黃單胞菌可以單獨形成生物被膜。但由于協同效應,四種菌可共同形成混合菌生物被膜,且個體菌株數量明顯高于單種生物被膜。由此可見,生物被膜內多菌株的共生作用可以促進胞外多糖等基質的產生聚集。基質凝聚力的加強不僅會增加生物膜內群落的多樣性,還會增強菌株的粘附力,從而增強了生物膜的持久性和耐藥性。

2.2 競爭作用

混合病原菌生物被膜內的微生物種間不僅存在互利共生作用,還存在競爭作用。競爭作用是指在營養物、最適生長環境等微生物生長的必需條件不足時,微生物間會發生爭奪,或通過自身的快速生長繁殖,更快奪取營養物質。在混合菌生物被膜中,某一微生物可通過弱化其他病原菌的粘附能力來增強自身粘附率[30]。Millezi等[31]通過對聚丙烯表面的大腸桿菌(Escherichiacoli)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)形成的雙種生物被膜的研究發現,雙菌種生物膜中的大腸桿菌降低了金黃色葡萄球菌的易感性,使得雙種生物膜中的金黃色葡萄球菌活細胞數量遠遠小于單種生物膜中金黃色葡萄球菌的活細胞數量。Wang等[32]發現,銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)會明顯降低腸道沙門氏菌(Salmonellaenterica)的生長速率,對混合病原菌生物被膜中的腸道沙門氏菌有抑制作用。Rüger等[33]通過流式細胞術方法對銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderiacepacia)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)形成的混合菌生物被膜進行了研究,發現銅綠假單胞菌在混合菌生物膜中的生長比其余兩株菌更具優勢,這種優勢是通過銅綠假單胞菌的拮抗性使得洋蔥伯克霍爾德菌和金黃色葡萄球菌的生長速率被抑制。Kuznetsova等[34]發現,銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)通過分泌體外代謝產物來抑制大腸桿菌(Escherichiacoli)的生長繁殖,使得大腸桿菌在銅綠假單胞菌和大腸桿菌形成的混合菌生物被膜中的代謝率降低。Makovcova等[35]通過對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、腸道沙門氏菌(Salmonellaenterica)、潛在致病性和非致病性大腸桿菌(Escherichiacoli)形成的單種和多種生物被膜生長率的研究可知,混合病原菌生物被膜中革蘭氏陰性菌比在單種生物被膜中生長的更好,但是混合菌生物被膜中的金黃色葡萄球菌菌群要明顯小于單種生物被膜中的金黃色葡萄球菌菌群。總而言之,混合菌生物被膜內的某一微生物會分泌可抑制其余微生物生長繁殖的代謝產物,或者利用自身生長優勢掠奪營養物質以弱化其它微生物的粘附力,從而在混合菌生物被膜中占據優勢。

3 群體感應機制

生物電化學系統(BESs)是用于電能生產、環境修復以及微生物代謝反應的前沿技術,其含有的化學活性微生物(EAMs)的電活性生物膜(EAB)可以通過各種電子傳遞方式與電極交換電子[36]。通常EAM通過三種方式向電極供電:地桿菌屬(Geobacteraceae)和希瓦氏菌屬(Shewanella)通過外膜細胞色素直接轉移電子;鐵呼吸菌屬(Ironrespiratoryfungus)是沿著模式生物體的導電菌毛直接傳輸電子;希瓦氏菌(Shewanella)釋放的抗體和由銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)產生的吩嗪通過自我合成的氧化還原介體間接轉移電子[37]。研究表明外部或內源性群體感應(QS)信號分子對電活性生物膜(EAB)有直接影響。

1994年Fuqua等[38]首次提出群體感應概念,Alexander等[39]于1965年在肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)中發現了第一個群體感應信號分子,至此群體感應系統被提出。群體感應(quorum sensing,QS)是一種廣泛存在于微生物細胞間的通訊機制。微生物通過分泌和響應特定的物理、化學信號分子來啟動細胞運動、化學生物合成和生物膜形成等行為[40]。QS可使細菌細胞間進行交流并協調他們的活動,因此,群體感應在食源性混合病原菌生物被膜的建立和發展中起著至關重要的作用。

3.1 AHLs介導的群體感應系統

N-酰基高絲氨酸內酯類(AHLs)是革蘭氏陰性菌最常見的QS信號分子。當微生物處于指數生長期時,自體誘導物分子(AI-1)會通過細胞膜運輸至微生物細胞外進行介導[41]。Yeon等[42]發現了群體感應淬滅現象,這種現象是因酰基轉移酶對高絲氨酸內酯和AHL酰基鏈之間的酰胺鍵造成不可逆地破壞,從而阻斷了信號通路。這一發現已被應用于解決污水處理中的生物膜污染問題。

3.2 AIPs介導的群體感應系統

革蘭氏陽性細菌中主要存在的自誘導物是寡肽(AIPs),寡肽自誘導物是從前體細胞加工修飾所得。AIPs具有高度特異性,它通過激活DNA結合蛋白的方式來調控靶基因的轉錄。Quadri等[43]發現,革蘭氏陽性細菌通常利用氨基酸和短肽來進行細胞間的基因調節。Miller等[44]進一步研究發現,AIPs介導的群體感應通常發生在微生物種內或菌種之間,且寡肽自誘導物會使宿主發生特異反應。

3.3 AI-2介導的群體感應系統

自體誘導物分子AI-2首次被發現于哈氏弧菌屬中,Bassler等[45]發現,哈氏弧菌中不僅存在AI-1信號分子,還存在另一種可進行種間交流的AI-2信號分子,它廣泛存在于革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌中,并可介導不同菌屬微生物間的相互交流。Ng等[46]證實,AI-2信號分子的合成與LuxS基因相關,一旦LuxS基因失活,AI-2信號分子將不會產生。

4 結論與展望

食源性病原菌生物被膜的形成特性和抑制方法已經受到食品領域專家的廣泛關注,并已取得了較大進展,但目前對于混合病原菌生物被膜的研究較少。由于食源性混合病原菌形成的生物被膜結構復雜且耐藥性更強,難以被抗生素等抑菌劑殺滅清除,因此,探究混合病原菌生物被膜的形成和相互作用機制尤為重要。混合菌生物被膜中的細菌菌落通常是由多種類型的微生物群落組成,它們之間的相互協調作用和分泌胞外多糖的能力在底物交換、重要代謝產物的分布和代謝終產物的排泄中起著至關重要的作用。因此通過控制外部環境條件以及營養成分等因素可以改變微生物的產糖能力,從而控制混合病原菌生物被膜的形成。此外,混合菌生物被膜間存在群體感應系統,探究群體感應信號分子的調控機制,是控制食源性混合病原菌生物被膜污染問題的突破口之一。