利用斑馬魚(yú)模型研究 瓊膠寡糖抗氧化機(jī)制

,,*,,, ,

(1.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003; 2.中國(guó)科學(xué)院海洋研究所,山東青島 266071; 3.福建環(huán)海生物科技股份有限公司,福建詔安 363502)

瓊膠(Agar)作為海洋紅藻植物細(xì)胞壁中的多糖成分,多從石花菜屬(Gelidium)或江蘺屬(Gracilaria)藻類提取獲得,常作為食品添加劑、微生物培養(yǎng)基等廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)和生物技術(shù)領(lǐng)域[1-2]。瓊膠雖無(wú)毒無(wú)害,但其粘度高、溶解性差,且作為生物大分子難以被人體吸收利用。這極大限制了其在醫(yī)藥、保健食品和化妝品中的高值化應(yīng)用[3]。通過(guò)酶法、酸法水解瓊膠獲得的瓊膠寡糖,分子量減小、水溶性好且易被人體吸收,其生物活性和應(yīng)用價(jià)值得到顯著提高[1]。

瓊膠寡糖(Agaro-oligosaccharide,AOS)多為1～10個(gè)瓊二糖重復(fù)結(jié)構(gòu)單位連接形成的低聚糖,根據(jù)碳鏈還原性末端結(jié)構(gòu)差異可劃分為瓊寡糖(3,6-內(nèi)醚-α-L-半乳糖殘基)和新瓊寡糖(β-D-半乳糖殘基)兩大系列[4]。作為新型的功能性海洋低聚糖,AOS可由酸法或酶法制得,且有多種生物活性,包括抗氧化[5]、抗炎[6-7]、抗腫瘤[8-9]、抗糖尿病[10]和益生元[4]等。Chen等[11-12]曾研究不同酸對(duì)瓊膠的降解產(chǎn)物的影響,結(jié)果表明鹽酸在一定條件下可將瓊膠降解為聚合度在2～10偶數(shù)瓊寡糖,且表現(xiàn)出一定的體外抗氧化活性。此外,許多研究證實(shí)AOS具有體外抗氧化活性[12-15],單一聚合度AOS在鼠類哺乳動(dòng)物中的抗氧化活性鮮有報(bào)道[12-16],未見(jiàn)多聚合度AOS混合物的體內(nèi)抗氧化活性報(bào)道。

利用小鼠等哺乳動(dòng)物模型研究天然物質(zhì)的抗氧化活性已較為普遍,但這一方法也存在成本高、周期長(zhǎng)、操作復(fù)雜等問(wèn)題。斑馬魚(yú)(Daniorerio),一種小型熱帶觀賞魚(yú),屬鯉科淡水脊椎動(dòng)物,由于其體型小、養(yǎng)殖成本低、繁殖周期短、產(chǎn)卵數(shù)目多、胚胎發(fā)育透明可見(jiàn)等優(yōu)勢(shì)已成為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織推薦的模式生物[17]。此外,斑馬魚(yú)全基因組測(cè)序結(jié)果表明了其與人類基因組有87%的同源性,使其成為研究人類疾病的模式動(dòng)物[18]。近年來(lái),斑馬魚(yú)作為模式動(dòng)物廣泛應(yīng)用于毒理評(píng)價(jià)、藥物篩選和生物活性評(píng)價(jià)等諸多領(lǐng)域[17],現(xiàn)已有利用斑馬魚(yú)模型評(píng)價(jià)海洋褐藻中多糖、多酚等物質(zhì)生物活性[19-20],但未見(jiàn)利用斑馬魚(yú)模型研究海洋紅藻AOS抗氧化活性的報(bào)道。

研究表明,一定濃度的2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽(AAPH)可刺激早期斑馬魚(yú)胚胎誘發(fā)其體內(nèi)的氧化應(yīng)激過(guò)程,機(jī)體產(chǎn)生過(guò)量且無(wú)法清除的活性氧(ROS),ROS又可造成一系列細(xì)胞損傷,引起細(xì)胞死亡[21-23]。熒光探針染料2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)本身無(wú)熒光,但可穿過(guò)生物體細(xì)胞膜進(jìn)入其細(xì)胞內(nèi),被胞內(nèi)酯酶水解成不能透過(guò)細(xì)胞膜的DCFH,從而使探針裝載到細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)活性氧在過(guò)氧化物酶存在下氧化無(wú)熒光的DCFH生成有熒光的二氯熒光素(DCF)[24],因此,DCF的熒光強(qiáng)度可顯示機(jī)體細(xì)胞內(nèi)活性氧相對(duì)水平。吖啶橙,一種核酸特異性的異染染料,通過(guò)嵌入或靜電吸引與DNA和RNA相互作用,可染色壞死或非常晚期的凋亡細(xì)胞[22,25]。由于斑馬魚(yú)胚胎、幼魚(yú)早期透明可見(jiàn),因此可通過(guò)熒光染料DCFH-DA、吖啶橙等特異性的檢測(cè)其體內(nèi)活性氧生成率和細(xì)胞死亡率,進(jìn)一步說(shuō)明其機(jī)體氧化應(yīng)激水平。

本實(shí)驗(yàn)利用優(yōu)化的斑馬魚(yú)氧化模型,研究了不同濃度的AOS基本毒性和抗氧化活性,為AOS在功能性食品和化妝品中的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

成年野生AB系斑馬魚(yú) 中國(guó)海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院分子醫(yī)學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供;瓊膠(提取原料為江蘺屬龍須菜) 福建環(huán)球海洋生物科技有限公司;AAPH、DCFH-DA、吖啶橙、三卡因 美國(guó)sigma公司;氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、硫酸鎂、亞甲基藍(lán)、鹽酸 分析純,上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;瓊二糖、瓊四糖、瓊六糖 日本Takara Bio Inc公司。

Agilent 1260 II液相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司;Thermo BioBasic SEC-120色譜柱(300 mm×7.8 mm) 美國(guó)Thermo公司;SPX-100B-Z型生化培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;SZ61體式顯微鏡 日本奧林巴斯;DMI 6000B倒置熒光顯微鏡 德國(guó)Leica公司;FA2004B電子天平 上海天美天平儀器有限公司;Milli Q純水機(jī) 默克密理博實(shí)驗(yàn)室設(shè)備(上海)有限公司;FD5-2.5冷凍干燥機(jī) 北京金西盟儀器有限公司;斑馬魚(yú)全自動(dòng)循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng) 北京愛(ài)生科技發(fā)展有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 AOS的制備 AOS的制備方法參考陳海敏等[26]的研究。將5 g瓊膠粉末加入100 mL 0.5 mol/L的鹽酸中攪拌均勻,加熱至100 ℃條件下反應(yīng)3 h后,再加入5 g瓊膠粉末繼續(xù)在100 ℃水解反應(yīng)3 h。反應(yīng)結(jié)束后,將水解產(chǎn)物冷卻至室溫后過(guò)濾、凍干(溫度:-55 ℃;時(shí)間:48 h;壓強(qiáng):<1.33 Pa)。

1.2.2 AOS成分測(cè)定 稱量0.05 g凍干粉末用1 mL去離子水溶解后,用高效液相色譜法測(cè)定其比例和組成,色譜柱為 Thermo BioBasic SEC-120色譜柱,檢測(cè)器為示差檢測(cè)儀檢測(cè),流速為0.5 mL/min,流動(dòng)相為40%甲醇。使用商品化的瓊二糖、瓊四糖和瓊六糖(均為5 mg/mL)作標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)制備的AOS進(jìn)行定性分析,根據(jù)出峰時(shí)間和峰面積計(jì)算各聚合度AOS的組成比例。

1.2.3 斑馬魚(yú)喂養(yǎng)及胚胎收集 斑馬魚(yú)飼養(yǎng)于全自動(dòng)循環(huán)系統(tǒng)中,參照Westerfield[27]的方法養(yǎng)殖、培育,(26±1) ℃水環(huán)境,光周期為照明14 h/黑暗10 h 交替進(jìn)行,每日以一定量的豐年蝦(鹵蟲(chóng))于早晚固定時(shí)間各飼喂一次。實(shí)驗(yàn)用胚胎由健康雌雄斑馬魚(yú)自然交配獲得。收集300～400枚胚胎于干凈培養(yǎng)皿中并移除排泄物、雜質(zhì)及未受精胚胎,加入胚胎培養(yǎng)液(10% NaCl,0.3% KCl,0.3% CaCl2,0.79% MgSO4,0.1%亞甲基藍(lán)),轉(zhuǎn)移于(28.5±1) ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～9 h。

1.2.4 胚胎給藥 篩選受精且發(fā)育至7～9 hpf(hours post fertilization,受精小時(shí))同時(shí)期的斑馬魚(yú)胚胎,移入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔15枚胚胎,除去殘留培養(yǎng)液后,根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),每孔分別加入用胚胎培養(yǎng)液稀釋的AOS活性物(25、50、100、150、200、400 μg/mL)或AAPH誘導(dǎo)物(10、15、20、25、30 mmol/L),純胚胎培養(yǎng)液作空白對(duì)照,每個(gè)濃度3個(gè)孔(平行)[21]。活性物和誘導(dǎo)物給藥后,將24孔板轉(zhuǎn)移于(28.5±1) ℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)待后續(xù)觀察及檢測(cè)。

1.2.5 AAPH誘導(dǎo)斑馬魚(yú)氧化模型優(yōu)化 根據(jù)文獻(xiàn)[21-23],選擇不同濃度(10、15、20、25、30 mmol/L)AAPH,進(jìn)行單因素的氧化應(yīng)激造模優(yōu)化。8～9 hpf給藥,3 dpf統(tǒng)計(jì)幼魚(yú)存活率、正常發(fā)育率,并檢測(cè)幼魚(yú)體內(nèi)活性氧生成率和細(xì)胞死亡率。

1.2.6 AOS毒性評(píng)價(jià) 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇50、100、200、400 μg/mL AOS在7～8 hpf給藥,3 dpf時(shí)期進(jìn)行幼魚(yú)存活率統(tǒng)計(jì)、幼魚(yú)體內(nèi)活性氧生成率和細(xì)胞死亡率的檢測(cè)。

1.2.7 AOS抗氧化活性評(píng)價(jià) 選擇無(wú)過(guò)氧化毒性的AOS安全濃度于7～8 hpf進(jìn)行胚胎給藥,在(28.5±1) ℃恒溫培養(yǎng)箱中預(yù)孵育,1 hpf后選用得到的最優(yōu)AAPH誘導(dǎo)濃度進(jìn)行氧化應(yīng)激誘導(dǎo),3 dpf時(shí)期進(jìn)行幼魚(yú)存活率統(tǒng)計(jì)、幼魚(yú)體內(nèi)活性氧生成率和細(xì)胞死亡率檢測(cè)。

1.2.8 指標(biāo)測(cè)定

1.2.8.1 斑馬魚(yú)表型觀察及存活率統(tǒng)計(jì) 每天于體式顯微鏡下觀察胚胎發(fā)育狀況,記錄并及時(shí)移除死亡胚胎(死亡胚胎發(fā)白,死亡幼魚(yú)無(wú)心跳,且尾部彎折),統(tǒng)計(jì)胚胎發(fā)育至3 dpf時(shí)期各孔幼魚(yú)存活率情況及發(fā)育狀況(存活率=3 dpf存活個(gè)數(shù)/總個(gè)數(shù),正常發(fā)育個(gè)數(shù)=3 dpf正常個(gè)數(shù)/總個(gè)數(shù))。

1.2.8.2 體內(nèi)活性氧生成率和細(xì)胞死亡率檢測(cè) 3 dpf時(shí)期,加入吖啶橙或DCFH-DA 等熒光試劑,于28 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育。后用三卡因麻醉劑麻醉幼魚(yú),于熒光顯微鏡下捕獲熒光圖片,并用Image J軟件分析、統(tǒng)計(jì)相對(duì)熒光強(qiáng)度。體內(nèi)細(xì)胞死亡率以吖啶橙染色后給藥組熒光強(qiáng)度與空白組熒光強(qiáng)度之比進(jìn)行統(tǒng)計(jì),體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生以DCFH-DA染色給藥組熒光強(qiáng)度與空白組熒光強(qiáng)度之比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有的實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次,結(jié)果以M±SD表示,通過(guò)one-way ANOVA對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,運(yùn)用多重比較Turkey檢驗(yàn)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)間的差異性。所示結(jié)果中,p<0.05判斷為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 AOS的組成

自制AOS的高效液相色譜見(jiàn)圖1。結(jié)果表明,制備的AOS為不同聚合度瓊寡糖混合物,主要是瓊二糖、瓊四糖和瓊六糖,占比分別為51.60%、28.40%、14.50%。課題組前期對(duì)瓊二糖、瓊四糖、瓊六糖分離純化后,分別測(cè)定了其細(xì)胞水平的抗氧化活性,結(jié)果表明,相同濃度下混合物的活性大于單一組分活性。因此,本論文以未經(jīng)純化的AOS混合樣品作為研究對(duì)象,探究其在斑馬魚(yú)體內(nèi)的抗氧化活性。

圖1 自制AOS的液相色譜圖Fig.1 HPLC spectrogram of the prepared AOS

2.2 AAPH誘導(dǎo)斑馬魚(yú)氧化模型優(yōu)化

2.2.1 AAPH誘導(dǎo)濃度對(duì)斑馬魚(yú)胚胎存活發(fā)育的影響 如圖2A所示,各實(shí)驗(yàn)濃度下的AAPH均導(dǎo)致了一定數(shù)量的胚胎死亡現(xiàn)象,且胚胎存活率與AAPH誘導(dǎo)濃度呈劑量依賴性下降,

圖2 AAPH誘導(dǎo)濃度對(duì)斑馬魚(yú)胚胎存活發(fā)育的影響Fig.2 Effect of AAPH-induced concentration on the survival and development of zebrafish embryo注:柱形圖上方不同字母代表 差異性顯著,p<0.05,圖4～圖10同。

但存活率都在50%以上,未達(dá)到半數(shù)致死劑量,均可供進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。但通過(guò)胚胎發(fā)育情況圖2B結(jié)果表明,高濃度(25、30 mmol/L)AAPH對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育造成嚴(yán)重?fù)p傷,正常發(fā)育率過(guò)低(40.77%、28.32%),且結(jié)合圖2C可知,3 dpf斑馬魚(yú)正常發(fā)育狀態(tài)如圖2C(f)所示,非正常發(fā)育狀態(tài)則如圖2C(a)～圖2C(e)所示,表現(xiàn)出發(fā)育遲緩、著色淺、卵黃囊腫大、尾部彎折、畸形等形態(tài),因此,較低的正常發(fā)育率不利于后續(xù)體內(nèi)熒光指標(biāo)檢測(cè),而低、中濃度(10、15、20 mmol/L)AAPH對(duì)斑馬魚(yú)胚胎損傷較為適宜,均可滿足后續(xù)檢測(cè)。

2.2.2 AAPH誘導(dǎo)濃度對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的影響 斑馬魚(yú)幼魚(yú)在低、中濃度AAPH誘導(dǎo)后的熒光檢測(cè)結(jié)果如圖3和圖4。結(jié)果表明,15 mmol/L AAPH誘導(dǎo)斑馬魚(yú)胚胎可顯著提高其幼魚(yú)體內(nèi)過(guò)氧化應(yīng)激水平(p<0.05),與空白組相比,其活性氧產(chǎn)生率能達(dá)109.37%,細(xì)胞死亡率可達(dá)121.43%,高于10、20 mmol/L AAPH誘導(dǎo)引起的過(guò)氧化應(yīng)激水平。因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇最優(yōu)15 mmol/L AAPH誘導(dǎo)濃度進(jìn)行造模誘導(dǎo)。此最優(yōu)濃度與Kim等[22]、Lee等[28]的AAPH誘導(dǎo)濃度相同,實(shí)驗(yàn)結(jié)果可取。

圖3 AAPH誘導(dǎo)濃度對(duì)斑馬魚(yú)體內(nèi)活性氧生成率的影響Fig.3 Effect of AAPH-induced concentration on the reactive oxygen species production rate in vivo

圖4 AAPH誘導(dǎo)濃度對(duì)斑馬魚(yú)體內(nèi)細(xì)胞死亡率的影響Fig.4 Effect of AAPH-induced concentration on the cell death rate in vivo

2.3 AOS毒性評(píng)價(jià)

2.3.1 不同濃度AOS對(duì)斑馬魚(yú)胚胎存活發(fā)育的影響 選擇較大濃度梯度(50、100、200、400 μg/mL)AOS進(jìn)行毒性評(píng)價(jià)的結(jié)果如圖5所示。50、100、200 μg/mL AOS對(duì)斑馬魚(yú)胚胎均無(wú)致畸、致死毒性,而高濃度400 μg/mL AOS對(duì)斑馬魚(yú)胚胎有較低的毒性,與空白對(duì)照組相比差異顯著(p<0.05),其存活率降低至93.33%。

圖5 AOS濃度對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的存活率的影響Fig.5 Effect of AOS concentration on survival rate of zebrafish embryos

2.3.2 不同濃度AOS對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的影響 如圖6、圖7,與空白組以及低濃度AOS組(≤200 μg/mL)相比,400 μg/mL AOS顯著提高了斑馬魚(yú)幼魚(yú)體內(nèi)的細(xì)胞死亡率(113.94%)和活性氧自由基產(chǎn)率(123.09%，p<0.05)。此外,200 μg/mL AOS對(duì)斑馬魚(yú)胚胎雖無(wú)致畸、致死作用(圖5),但與空白組相比(圖6),該濃度下斑馬魚(yú)幼魚(yú)體內(nèi)活性氧自由基水平表現(xiàn)出非顯著性的升高(103.93%),表現(xiàn)出極弱的氧化刺激作用。因此可推測(cè),低于200 μg/mL濃度的AOS對(duì)斑馬魚(yú)無(wú)胚胎損傷和氧化刺激,可作為活性評(píng)價(jià)的安全濃度。

圖6 AOS濃度對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)體內(nèi)活性氧生成率的影響Fig.6 Effect of AOS concentration on the reactive oxygen species production rate in vivo

圖7 AOS濃度對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)體內(nèi)細(xì)胞死亡率的影響Fig.7 Effect of AOS concentration on the cell death rate in vivo

Wijesinghe等[29]發(fā)現(xiàn)紅藻江蘺屬(Laurenciasnackeyi)藻中活性物質(zhì)5-Hydroxypalisadin B對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)的氧化應(yīng)激毒性,研究表明濃度為5 μg/mL時(shí)時(shí)可顯著提高斑馬魚(yú)幼魚(yú)體內(nèi)的細(xì)胞死亡率,發(fā)生過(guò)氧化應(yīng)激反應(yīng),而本實(shí)驗(yàn)中400 μg/mL AOS才顯著提高幼魚(yú)體內(nèi)的細(xì)胞死亡率(p<0.05),表明AOS的氧化應(yīng)激毒性較弱,應(yīng)用前景更廣。

2.4 AOS活性評(píng)價(jià)

2.4.1 不同濃度AOS對(duì)AAPH誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)胚胎存活率的影響 由圖8可知,與對(duì)照組相比,各濃度組AOS對(duì)AAPH誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)氧化損傷均表現(xiàn)出顯著保活作用(p<0.05),其中25、50、100 μg/mL AOS預(yù)孵育后,斑馬魚(yú)存活率由70%劑量依賴性地分別提高至80.00%、90.00%、96.88%。其最優(yōu)AOS濃度為100 μg/mL,經(jīng)該濃度AOS預(yù)孵育后,斑馬魚(yú)存活率與空白組無(wú)顯著差異(p>0.05)。

圖8 AOS對(duì)AAPH誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)胚胎的存活率的影響Fig.8 Effect of AOS on survival rate of AAPH-induced zebrafish embryos 注:+即前期給藥;-即前期未給藥,圖9～圖10同。

2.4.2 不同濃度AOS對(duì)AAPH誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)幼魚(yú)體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的影響 前期15 mmol/L AAPH給藥刺激斑馬魚(yú)胚胎,使斑馬魚(yú)氧化損傷死亡率達(dá)30%左右。由圖9知,受AAPH誘導(dǎo)刺激存活的胚胎發(fā)育到3 dpf幼魚(yú)出膜時(shí)期,其體內(nèi)的活性氧自由基產(chǎn)生率較未受AAPH誘導(dǎo)的空白組而言顯著升高(108.87%,p<0.05);而預(yù)孵育AOS(25、50、100 μg/mL)后,其體內(nèi)的活性氧自由基生成率劑量依賴性的下降(106.62%、102.81%、100.53%),且當(dāng)AOS濃度為100 μg/mL時(shí),其體內(nèi)的活性氧自由基生成率同空白組無(wú)顯著性差異(100.53%,p>0.05)。預(yù)孵育150 μg/mL AOS時(shí),不能降低AAPH誘導(dǎo)引起產(chǎn)生的過(guò)多活性氧,且此情況下斑馬魚(yú)幼魚(yú)體內(nèi)活性氧生成率為109.28%,略高于僅AAPH誘導(dǎo)組,為108.87%。由此可見(jiàn),100 μg/mL AOS為最優(yōu)抗氧化濃度。

圖9 AOS對(duì)AAPH誘導(dǎo)的斑馬魚(yú) 幼魚(yú)體內(nèi)活性氧生成率的影響Fig.9 Effect of AOS on the reactive oxygen species production rate of AAPH-induced zebrafish in vivo

斑馬魚(yú)3 dpf時(shí)期用吖啶橙對(duì)存活幼魚(yú)進(jìn)行細(xì)胞死亡特異性染色如圖10。與空白組相比,僅AAPH誘導(dǎo)組其細(xì)胞死亡率顯著性升高(120.37%,p<0.05),實(shí)驗(yàn)中預(yù)孵育各濃度AOS(25、50、100、150 μg/mL)均降低了由AAPH氧化損傷引起的細(xì)胞死亡率。此外,用25、50、100 μg/mLAOS預(yù)孵育斑馬魚(yú)胚胎,能劑量依賴性地降低由AAPH引起的高細(xì)胞死亡率,且預(yù)孵育濃度為100 μg/mL時(shí)斑馬魚(yú)幼魚(yú)體內(nèi)死亡率與空白組無(wú)顯著性差異(p>0.05)。而預(yù)孵育150 μg/mL AOS時(shí),斑馬魚(yú)幼魚(yú)體內(nèi)細(xì)胞死亡率較100 μg/mL濃度組(101.69%)非顯著性的升高(107.94%)。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明100 μg/mL AOS為最優(yōu)抗氧化濃度。

圖10 AOS對(duì)AAPH誘導(dǎo)的斑馬魚(yú) 幼魚(yú)體內(nèi)細(xì)胞死亡率的影響Fig.10 Effect of AOS on cell death rate of AAPH-induced zebrafish in vivo

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明了一定濃度的AOS具有良好的抗氧化活性,且其最優(yōu)抗氧化濃度為100 μg/mL,這一結(jié)果優(yōu)于Kim等[23]利用同一模型研究的褐藻糖膠的最優(yōu)抗氧化濃度(200 μg/mL)。由此可見(jiàn),AOS的抗氧化活性較高,具有極大的利用價(jià)值和市場(chǎng)前景。

3 結(jié)論與討論

本研究?jī)?yōu)化了AAPH誘導(dǎo)斑馬魚(yú)氧化應(yīng)激模型,并利用該模型首次評(píng)價(jià)了AOS的抗氧化活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在最優(yōu)AAPH誘導(dǎo)濃度(15 mmol/L)下,斑馬魚(yú)幼魚(yú)體內(nèi)氧化應(yīng)激達(dá)到最高水平,低于200 μg/mL濃度瓊膠寡糖對(duì)斑馬魚(yú)胚胎無(wú)明顯氧化損傷。一定濃度瓊膠寡糖(25、50、100 μg/mL)劑量依賴性的減小斑馬魚(yú)體內(nèi)氧化應(yīng)激水平,100 μg/mL瓊膠寡糖不僅顯著提高AAPH誘導(dǎo)引起的低存活率(p<0.05),而且顯著降低AAPH誘導(dǎo)引起的斑馬魚(yú)幼魚(yú)體內(nèi)高活性氧生成率和細(xì)胞死亡率(p<0.05),且實(shí)驗(yàn)中使用的瓊膠寡糖抗氧化效果優(yōu)于已報(bào)道的褐藻糖膠[23]。

已報(bào)道的AOS抗氧化作用機(jī)理有多種,宋香凝等[5]的體外自由基清除實(shí)驗(yàn)已證明AOS對(duì)自由基清除能力強(qiáng)弱為:羥自由基的清除能力>ABTS自由基清除能力>DPPH自由基清除能力;Chen等[12,16]利用H2O2誘導(dǎo)損傷的人肝臟細(xì)胞氧化模型研究了不同聚合度AOS通過(guò)清除胞內(nèi)活性氧自由基(ROS)表現(xiàn)出不同的抗氧化活性;薛長(zhǎng)湖等[14]、陳海敏[15]通過(guò)對(duì)肝損傷的鼠氧化模型灌胃AOS的研究表明,AOS可以提高小鼠體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽酶(GSH)等抗氧化酶的活性清除多余自由基,最終達(dá)到抗氧化的目的。本研究結(jié)果則表明了AOS的又一抗氧化機(jī)理,即一定濃度AOS(25、50、100 μg/mL)可通過(guò)直接清除AAPH誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)幼魚(yú)體內(nèi)ROS,和減少細(xì)胞死亡率實(shí)現(xiàn)其抗氧化活性,不僅佐證了AOS的潛在抗氧化活性,而且為AOS作為天然抗氧化資源的開(kāi)發(fā)利用提供了又一理論依據(jù)。而瓊二糖、瓊四糖和瓊六糖的混合物,其混合協(xié)同作用及在機(jī)體內(nèi)的作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。