桂七青芒果皮多糖提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化 及其體外抗氧化活性

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(百色學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,桂西區(qū)域生態(tài)環(huán)境分析和污染控制重點(diǎn)試驗(yàn)室,廣西百色 533000)

芒果是我國(guó)著名的土特產(chǎn)之一,因具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、鮮美豐腴的口味而廣為消費(fèi)大眾熟悉并喜愛(ài)。廣西百色市右江河谷芒果產(chǎn)量及質(zhì)量均位居國(guó)內(nèi)前列,被譽(yù)為“中國(guó)芒果之鄉(xiāng)”。百色芒果種類(lèi)繁多,其中的桂七青芒是百色地區(qū)特有的芒果名品,以其香氣濃郁、纖維含量低、果肉香甜不膩受到廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)。目前,桂七青芒的主要消費(fèi)方式仍然以鮮食為主,果皮即以垃圾的形式舍棄。桂七青芒果皮較厚,纖維含量較大,自然降解慢。果皮作為芒果果實(shí)的一部分同樣含有大量多糖[1-4],大量的果皮被遺棄,不僅是資源的一種浪費(fèi),同時(shí)亦會(huì)對(duì)環(huán)境造成較大的污染。因此,芒果果皮亟待再利用。

熱水浸提法是一種應(yīng)用極為普遍的植物多糖的提取方法,優(yōu)勢(shì)在于能夠較好的保證多糖結(jié)構(gòu)的完整性,但也具有時(shí)間長(zhǎng)、效率低的缺陷。為了調(diào)高提取效率,科研工作者經(jīng)常采取一些措施,超聲波輔助是其中之一[5-6]。超聲波主要通過(guò)機(jī)械作用破壞細(xì)胞組織,對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)及抗氧化活性幾乎沒(méi)有影響[7]。目前尚未關(guān)于桂七青芒果皮中多糖的提取及其抗氧化活性測(cè)試的報(bào)道,因此,本課題研究采用超聲波輔助熱水浸提法提取桂七青芒果皮中的多糖,優(yōu)化工藝條件,并開(kāi)展多糖生物活性的體外測(cè)試,為促進(jìn)芒果果皮的開(kāi)發(fā)利用提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

桂七青芒果皮青綠無(wú)黑點(diǎn) 百色市右江區(qū)城西大型農(nóng)產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng);三氯乙酸、鄰苯三酚、2,2′-聯(lián)氮基雙(2-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、鐵氰化鉀[K3Fe(CN)6]、抗壞血酸(VC)均為分析純 上海麥克林生化科技有限公司;乙醇、濃硫酸、苯酚等其他常用化學(xué)試劑及藥品 均為分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

KQ-202KDB型高功率數(shù)控超聲波清洗器 超聲波儀器有限公司;UV-2800型紫外可見(jiàn)分光光度儀 上海美普達(dá)儀器有限公司;SHA-B型恒溫水浴振蕩器 常州國(guó)華電器有限公司;DHG-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;SHA-B型恒溫水浴振蕩器 常州國(guó)華電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 桂七青芒果皮粉末樣品的制備 剝?nèi)」鹌咔嗝⒌墓?去除殘余果肉后洗凈并切成2 cm×4 cm×0.3 cm的條狀碎塊,置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中60 ℃烘干至前后兩次質(zhì)量之差不超過(guò)0.01 g。粉碎,過(guò)60目篩制得果皮粉末樣品。果皮粉末密封在自封袋中,避光冷藏(4 ℃)保存,以備使用[8]。

1.2.2 多糖的提取 在圓底燒瓶中按一定比例加入桂七青芒果皮粉末及蒸餾水,在一定的超聲功率和溫度下,超聲提取一定時(shí)間。相同條件下反復(fù)提取三次,合并提取液,Sevag法去蛋白,過(guò)濾,得多糖提取液[9]。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱(chēng)取桂七青芒果皮粉末1.000 g,固定其它因素及水平[10-11]:液料比60∶1 mL/g,超聲時(shí)間20 min,超聲功率700 W,考察不同溫度:45、55、65、75、85、100 ℃對(duì)多糖提取效果的影響情況;

固定其它因素及水平:提取溫度65 ℃、超聲時(shí)間20 min,超聲功率700 W,考察不同液料比:25∶1、40∶1、60∶1、80∶1、100∶1 mL/g對(duì)多糖提取效果的影響情況;

固定其它因素及水平:提取溫度65 ℃、液料比60∶1 mL/g、超聲功率700 W,考察不同超聲時(shí)間:10、15、20、25、30 min對(duì)多糖提取效果的影響情況;

固定其它因素及水平:提取溫度65 ℃、液料比60∶1 mL/g、超聲時(shí)間20 min,考察不同超聲功率:200、400、600、700、800 W對(duì)多糖提取效果的影響情況。

1.2.4 多糖提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化 以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為參考,以多糖得率為響應(yīng)值(Y),提取溫度(A)、液料比(B)及超聲功率(C)為自變量,截取任意一因素內(nèi)顯著影響多糖提取效果的三個(gè)水平,利用Design-Expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken法設(shè)計(jì)并安排提取多糖的優(yōu)化試驗(yàn)以獲取最佳工藝參數(shù)[12]。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Variables and levels in the response surface experiment design

1.2.5 多糖得率的測(cè)定

1.2.5.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 精確配制并移取0.1000 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.00、10.00、20.00、40.00、60.00、70.00 mL至100 mL容量瓶中,蒸餾水稀釋,定容,配制濃度分別為0.00、10.00、20.00、40.00、60.00、70.00 μg/mL葡萄糖待測(cè)液。

準(zhǔn)確移取上述6種不同濃度的葡萄糖待測(cè)液各2.00 mL至干燥的試管中,分別依次加入5%苯酚溶液3.00 mL及濃硫酸15.00 mL,混合均勻,置于40 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)30 min后取出,冷卻至室溫,于490 nm處測(cè)定體系吸光度[13]。以吸光度A對(duì)葡萄糖濃度c(μg/mL)進(jìn)行線(xiàn)性回歸,得回歸方程為:A=0.126c-2.076×10-3,R2=0.9995。

1.2.5.2 提取液中多糖含量的測(cè)定 將多糖提取液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至30 mL后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中,定容,測(cè)定體系吸光度,代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程計(jì)算多糖含量。

1.2.5.3 多糖得率的計(jì)算 按照式(1)計(jì)算多糖得率(%)。

多糖得率(%)=多糖含量×100/桂七青芒果皮粉末樣品質(zhì)量

式(1)

1.2.6 多糖抗氧化活性的體外測(cè)試

1.2.6.1 多糖溶液的配制 多糖提取液濃縮至100 mL,并轉(zhuǎn)移至1.0 L的錐形瓶中,加入四倍量無(wú)水乙醇,混合均勻并將錐形瓶置于冰箱中冷藏(4 ℃)、醇沉。72 h后,濃縮除去大部分溶劑。濃縮液3000 r/min離心10 min,棄去上清液,收集底部沉淀。沉淀經(jīng)丙酮洗滌至丙酮洗液無(wú)色后,再用少量蒸餾水溶解,冷凍干燥,得固體多糖。稱(chēng)取一定質(zhì)量的固體多糖,少量蒸餾水溶解,定容至50 mL,配制不同濃度的多糖溶液(1.6、2.2、2.9、3.6、4.3 mg/mL)。

1.2.6.2 對(duì)羥基自由基(·OH)清除效果的測(cè)定 分別向5支干燥試管中依次加入0.1500 mmol/L硫酸亞鐵溶液1.00 mL,2.000 mmol/L水楊酸-乙醇溶液0.40 mL、蒸餾水0.40 mL、6.000 mmol/L過(guò)氧化氫溶液1.00 mL、不同濃度多糖溶液0.20 mL,混合均勻,置于37 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)1 h,510 nm處測(cè)定體系吸光度Ax(x=1～5)。固定其它條件及試驗(yàn)流程,以蒸餾水代替過(guò)氧化氫溶液,測(cè)定對(duì)照吸光度Ax0;以蒸餾水代替多糖溶液,測(cè)定空白吸光度A0,按式(2)計(jì)算多糖對(duì)·OH的清除率[14]:

·OH清除率 η(%)=[A0-(Ax-Ax0)]×100/A0

式(2)

式(3)

1.2.6.4 對(duì)ABTS自由基清除效果的測(cè)定 分別向5支干燥試管中依次加入不同濃度多糖溶液0.20 mL、6.999 mmol/L ABTS溶液3.00 mL。混合均勻后,將五支試管置于黑暗環(huán)境中室溫反應(yīng)1 h,734 nm處測(cè)定體系吸光度Ax(x=1～5)。固定其它條件及試驗(yàn)流程,以pH=7.4磷酸緩沖生理鹽水代替ABTS溶液,測(cè)定對(duì)照吸光度A0,按式(4)計(jì)算多糖對(duì)ABTS自由基的清除率[16]:

ABTS自由基清除率η(%)=(A0-Ax)×100/A0

式(4)

1.2.6.5 總還原力的測(cè)定 分別向5支干燥試管中依次加入不同濃度多糖溶液1.00 mL、pH=6.6磷酸緩沖溶液2.50 mL、1%鐵氰化鉀溶液2.50 mL,混合均勻,置于50 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)25 min。取出,冷卻至室溫,繼續(xù)加入10%三氯乙酸溶液2.50 mL,3000 r/min恒速離心10 min。取上清液2.50 mL,依次加入蒸餾水2.50 mL、1%三氯化鐵溶液1.00 mL,混合均勻,室溫反應(yīng)10 min,700 nm處測(cè)定體系吸光度Ax(x=1～5)。固定其它條件及試驗(yàn)流程,以蒸餾水代替鐵氰化鉀溶液,測(cè)定對(duì)照吸光度Ax0;以蒸餾水代替多糖溶液,測(cè)定空白吸光度A0,按式(5)計(jì)算多糖的總還原力(總還原力吸光度成正比)[17]:

總還原力η=Ax-Ax0-A0

式(5)

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 9.0進(jìn)行整理和繪圖;同時(shí)利用Design-Expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken法進(jìn)行回歸模型方程的建立及方差分析,獲取響應(yīng)值最大時(shí)各因素的最佳組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 提取溫度對(duì)多糖得率的影響 由圖1可以看出,多糖的得率隨溫度增高而提升,提取溫度設(shè)定在65 ℃時(shí),得率達(dá)到最大值13.83%。溫度繼續(xù)升高,多糖得率迅速下降。當(dāng)體系溫度較低時(shí),多糖分子的運(yùn)動(dòng)能力隨溫度的升高而增大,易從樣品中溶出并擴(kuò)散到溶劑中,多糖得率上升。但有機(jī)分子對(duì)溫度變化較為敏感,多糖分子在較高溫度時(shí)易失去生物活性以沉淀形式析出導(dǎo)致多糖得率下降。因此,提取溫度設(shè)定為65 ℃較為合適。

圖1 提取溫度對(duì)多糖得率的影響Fig.1 Effect of temperature on polysaccharides yield

2.1.2 液料比對(duì)多糖得率的影響 由圖2可以看出,當(dāng)液料比<60∶1 mL/g時(shí),多糖得率升高且增速明顯;當(dāng)液料比為60∶1 mL/g時(shí),多糖得率達(dá)到最大值13.83%,液料比繼續(xù)增加,多糖得率開(kāi)始緩慢下降。多糖總量一定,適當(dāng)增加溶劑用量,增大的擴(kuò)散壓促使更多的多糖分子向溶劑中擴(kuò)散,多糖得率隨之上升。過(guò)度增大液料比使得溶劑用量增速快于多糖得率增速,造成溶劑浪費(fèi),同時(shí)亦會(huì)導(dǎo)致樣品其它雜質(zhì)成分溶出。雜質(zhì)成分的增多可能會(huì)抑制多糖的溶出,得率緩慢下降。綜合提取效率及后續(xù)濃縮工作,本著節(jié)約的原則,液料比設(shè)定為60∶1 mL/g較為合適。

圖2 液料比對(duì)多糖得率的影響Fig.2 Effect of liquid-material ratio on polysaccharides yield

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)多糖得率的影響 由圖3可知,多糖得率在一定時(shí)間內(nèi)隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加,超聲時(shí)間為20 min時(shí)多糖得率達(dá)到最大值13.69%,繼續(xù)延長(zhǎng)超聲時(shí)間,多糖得率下降。超聲波的主要作用在于破碎樣品細(xì)胞的細(xì)胞壁,延長(zhǎng)超聲時(shí)間,細(xì)胞壁破碎充分,有利于多糖分子從樣品細(xì)胞中溶出并向外擴(kuò)散,多糖得率上升。超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng),體系空化作用加劇,伴隨空化過(guò)程產(chǎn)生的局部高溫會(huì)使多糖分子分解甚至失活,多糖得率下降。因此,超聲時(shí)間設(shè)定為20 min較為合適。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on polysaccharides yield

2.1.4 超聲功率對(duì)多糖得率的影響 由圖4可以看出,多糖得率隨超聲功率增加而迅速升高,當(dāng)超聲功率為600 W時(shí),多糖得率取得最大值14.01%。當(dāng)超聲功率高于700 W后,多糖得率隨超聲功率增加迅速下降。在一定的超聲時(shí)間內(nèi),細(xì)胞壁的破碎效果隨超聲功率的增加而愈加充分,多糖分子被充分溶出,得率上升。超聲功率過(guò)大導(dǎo)致體系局部過(guò)熱,多糖分子受高溫影響失去生物活性以沉淀形式析出導(dǎo)致多糖得率下降。因此,超聲功率設(shè)定為600 W較為合適。

圖4 超聲功率對(duì)多糖得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on polysaccharides yield

2.2 提取工藝的響曲面優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析 通過(guò)對(duì)桂七青芒果皮多糖提取的單因素試驗(yàn)考察可知,多糖得率的波動(dòng)幅度隨超聲時(shí)間延長(zhǎng)較其他因素小,說(shuō)明超聲時(shí)間為四個(gè)考察因素中的次要因素。因此,設(shè)立多糖得率為響應(yīng)值(Y),提取溫度(A)、液料比(B)、超聲功率(C)三因素為自變量,利用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)三因素三水平優(yōu)化試驗(yàn),安排并實(shí)施17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn),試驗(yàn)方案及結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.2.2 回歸方程的方差分析及顯著性檢驗(yàn) 利用Design-Expert 8.0.6軟件程序?qū)Ρ?中展示的優(yōu)化設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合分析,獲得多糖得率(Y)對(duì)提取溫度(A)、液料比(B)、超聲功率(C)的三元二次回歸方程:

Y=-65.55694+1.03220A+0.08345B+0.13581C+8.25000×10-4AB-4.67500×10-4AC+9.50000×10-5BC-5.95250×10-3A2-1.35687×10-3B2-9.05250×10-5C2

表3 回歸模型的方差分析表Table 3 Variance analysis of regression model

通過(guò)模型的方差分析可知,提取溫度A(p=0.0038)、液料比B(p<0.0001)、超聲功率C(p=0.0062)三因素及其二次項(xiàng)對(duì)多糖得率的影響均達(dá)到極顯著水平(p<0.01),主次順序?yàn)?液料比>提取溫度>超聲功率。方差分析顯示三因素之間存在交互作用,其中,交互作用AC(p=0.0013)對(duì)多糖得率的影響極顯著,而交互作用AB(p=0.1130)、BC(p=0.0754)的影響不顯著。

2.2.3 交互作用對(duì)多糖得率影響的響應(yīng)面分析 依據(jù)回歸方程的方差分析,利用Design-Expert 8.0.6軟件繪制出三因素中任意兩因素之間的交互作用響應(yīng)面分析圖。在響應(yīng)面分析圖中,響應(yīng)曲面的陡峭程度越大,說(shuō)明相應(yīng)的交互作用對(duì)多糖得率的影響越顯著。對(duì)比圖5～圖7可以發(fā)現(xiàn),交互作用AC的響應(yīng)曲面具有顯著的陡坡,而交互作用AB、BC響應(yīng)曲面坡度小而相對(duì)平滑,說(shuō)明交互作用AC的影響極顯著。等高線(xiàn)圖中軸向等高線(xiàn)密度與交互作用影響強(qiáng)度成正比。比較圖5～圖7中等高線(xiàn)圖,交互作用AC軸向等高線(xiàn)密度明顯高于交互作用AB、BC,亦說(shuō)明交互作用AC的影響極顯著。響應(yīng)面分析結(jié)果與方差分析中顯著性的結(jié)果相一致。

圖5 交互作用AB對(duì)多糖得率影響的響應(yīng)面分析圖Fig.5 Response surface ofinteractive AB effect on polysaccharides yield

圖6 交互作用AC對(duì)多糖得率影響的響應(yīng)面分析圖Fig.6 Response surface ofinteractive AC effect on polysaccharides yield

圖7 交互作用BC對(duì)多糖得率影響的響應(yīng)面分析圖Fig.7 Response surface of interactive BC effect on polysaccharides yield

2.2.4 提取工藝最佳參數(shù)的確定及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 經(jīng)過(guò)Design-Expert 8.0.6對(duì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)數(shù)據(jù)的回歸分析,確定最佳提取工藝參數(shù):提取溫度67.66 ℃,液料比72.80∶1 mL/g,超聲功率613.61 W,在此條件下多糖得率可達(dá)14.06%。便于實(shí)際試驗(yàn)操作,調(diào)整工藝參數(shù)為:提取溫度68 ℃,液料比73∶1 mL/g,超聲功率620 W,超聲時(shí)間20 min。嚴(yán)格執(zhí)行所得最佳工藝條件,平行實(shí)驗(yàn)5次,桂七青芒果皮多糖的實(shí)測(cè)平均得率為13.64%±0.12%,與模型預(yù)測(cè)值14.06%相對(duì)誤差在3%以?xún)?nèi),說(shuō)明該工藝切實(shí)可行。

2.3 多糖的抗氧化活性體外測(cè)試

2.3.1 對(duì)·OH清除效果的測(cè)定 ·OH主要通過(guò)奪取飽和氫原子而影響機(jī)體健康,多糖分子中含有較多的活性氫原子可與之發(fā)生反應(yīng),從而消除·OH對(duì)機(jī)體健康的危害。由圖8可以看出,桂七青芒果皮多糖具有一定的清除·OH的能力,且清除效果隨著多糖濃度的增加而增強(qiáng),當(dāng)多糖濃度為4.3 mg/mL時(shí)對(duì)·OH的清除率達(dá)到52.41%,但明顯弱于各階段相同濃度VC的清除能力。

圖8 桂七青芒果皮多糖對(duì)·OH的清除效果測(cè)定Fig.8 Scavenging effect of polysaccharides from guiqi-mango peel on ·OH

圖9 桂七青芒果皮多糖對(duì)的清除效果Fig.9 Scavenging effect of polysaccharides from guiqi-mango peel on

2.3.3 對(duì)ABTS自由基清除效果的測(cè)定 ABTS自由基是一種氮自由基,該種自由基由于與相鄰苯環(huán)發(fā)生p-π共軛而具有較高的穩(wěn)定性。由圖10可以看出,在多糖濃度較低時(shí)(<3.0 mg/mL)對(duì)ABTS自由基的清除能力隨濃度增加增速明顯,當(dāng)多糖濃度>3.0 mg/mL時(shí)清除率增速趨緩,當(dāng)多糖濃度為4.3 mg/mL時(shí)對(duì)ABTS自由基的清除率達(dá)到59.10%,但均弱于各階段相同濃度VC對(duì)ABTS自由基的清除能力。

圖10 桂七青芒果皮多糖對(duì)ABTS自由基的清除效果Fig.10 Effect of polysaccharides from guiqi-mango peel on ABTS radical

2.3.4 總還原力的測(cè)定 多糖分子中含有醛羰基,可還原氧化劑,因而具有較強(qiáng)的還原能力。由圖11可以看出,多糖總還原力在低濃度階段(<3.6 mg/mL)隨濃度增加迅速提高;當(dāng)多糖濃度>3.6 mg/mL時(shí),總還原力繼續(xù)增加但增速趨緩。當(dāng)多糖濃度為4.3 mg/mL時(shí),總還原力達(dá)到0.455。在所測(cè)定的濃度范圍內(nèi),多糖的總還原力均明顯低于相同濃度VC的總還原力。

圖11 桂七青芒果皮多糖的總還原力Fig.11 Total reducing power of polysaccharides from guiqi-mango peel

3 結(jié)論

本課題采用超聲波輔助熱水浸提法提取桂七青芒果皮中的多糖,并通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,建立三元二次回歸模型。在模型分析的基礎(chǔ)上方便實(shí)際操作,確定多糖提取的最佳工藝參數(shù):提取溫度68 ℃,液料比為73∶1 mL/g,超聲功率620 W,超聲時(shí)間20 min,該條件下實(shí)測(cè)多糖得率為13.64%±0.12%,與模型預(yù)測(cè)值14.06%相差<3%,說(shuō)明該工藝切實(shí)可行。多糖的抗氧化活性體外測(cè)試結(jié)果表明多糖具有較好的抗氧化活性,當(dāng)多糖濃度為4.3 mg/mL時(shí),對(duì)羥基自由基、超氧陰離子自由基、ABTS自由基的清除率分別達(dá)到52.41%、83.47%、59.10%,總還原力達(dá)到0.455,且其抗氧化能力與濃度成正向線(xiàn)性關(guān)系。本課題的研究結(jié)果為桂七青芒果皮中多糖的提取及百色芒果的綜合開(kāi)發(fā)利用提供了一定的數(shù)據(jù)支持。