景天三七總黃酮的純化、 自由基清除活性及初步鑒定

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(1.西南科技大學生命科學與工程學院,四川綿陽 621010; 2.四川省生物質資源利用與改性工程技術研究中心,四川綿陽 621010)

景天三七(SedumaizoonL.),景天科植物又被稱為高鈣菜、救心菜、土三七等[1],四川、浙江、陜西、甘肅、山西、寧夏、湖北、青海等地均有種植[2]。景天三七營養豐富,有研究表明,景天三七具有降低血管硬化、促進新陳代謝、抗氧化及解毒消腫等[3-5]作用,是有一定藥食潛力的資源。景天三七具有種植范圍廣,環境適應性強,且采收期長等優點,可以為功能性提取物的生產加工提供穩定的原料來源。近年來,黃酮類化合物的研究在食品領域趨于熱門,加快了對具有良好功能性的藥食同源的植物資源的開發,付煜榮等[6]采用顏色反應檢識證明景天三七中含有黃酮類化合物。張興桃等[7]通過超臨界CO2萃取景天三七總黃酮。

目前,對景天三七功能性成分的研究與開發主要集中在黃酮類、生物堿、甾醇[8-11]等活性成分。黃酮類化合物具有抗氧化性、抗炎癥、抗病毒、抗菌[12-13]等功效,并對防治癌癥、腫瘤、心血管[14-16]等疾病具有重要意義。而關于景天三七中的黃酮類化合物純化及性質研究較少。本研究基于文獻報道[17-19],選用大孔樹脂靜態吸附方法純化景天三七總黃酮,并研究了景天三七總黃酮最佳純化工藝及其性質,為景天三七中黃酮類化合物的系統性研究做出一定的補充。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

景天三七 均于2017年8月采自西南科技大學蔬菜實驗園,新鮮,無蟲害,并由統一干燥方法加工制樣;蘆丁對照品 南京替斯艾么中藥研究所 標準品;二苯代苦味肼基自由基(DPPH)、ABTS SIGMA ALDRICH 公司,分析純,抗氧化劑;乙醇、鹽酸、三氯乙酸、鐵氰化鉀、四硼酸鈉、硝酸鋁、抗壞血酸、鎂粉、鋅粉 成都市科龍化工試劑廠,分析純;D-101、AB-8、X-5、DA-201型大孔樹脂 成都市科龍化工試劑廠。

U-3900H型紫外分光光度計 Hitachi日立公司;Agilent1200系列LC-MS 安捷倫公司;pH 510酸度計 EUTECH INSTRUMENTS公司;FD-T12N-80型冷凍真空干燥儀 Thermo Electron Corporation;DJ靈巧型中藥粉碎機 海淀久中藥機械制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 景天三七總黃酮粗提物樣品液的制備 景天三七燙漂30 s后55 ℃烘干,置入中藥粉碎機粉碎,粉末過40目篩,取100 g粉碎后的景天三七經由乙醇浸提(81 ℃,90%乙醇,料液比1∶44,浸提3 h),采用旋轉蒸發除醇后加入等體積石油醚萃取除雜,再次旋轉蒸發除去石油醚,加入95%乙醇溶解,低溫靜置12 h后經離心(4500 r/min,15 min)取上清液,濃縮除醇,進行預凍過夜(0 ℃)后置于真空冷凍干燥機中干燥36 h得景天三七總黃酮粉末。精確稱取0.1000 g總黃酮粉末,用30%乙醇微熱溶解后,用同濃度乙醇定容到100 mL,得1.00 mg·mL-1景天三七總黃酮粗提物樣品液,測定總黃酮實際含量,備用。

1.2.2 大孔樹脂的預處理 預處理過程為:將各樹脂用95%乙醇浸泡24 h后依次用乙醇、去離子水沖洗,至洗盡醇味;用5%鹽酸溶液處理,用去離子水洗至中性;最后用5%NaOH溶液處理,用去離子水洗至中性,保存備用。

1.2.3 總黃酮含量測定 以蘆丁標準品為對照,采用NaNO2-Al(NO3)3法[20]測定黃酮含量;進行蘆丁標準曲線的繪制和回歸方程的建立,根據標準曲線計算所得回歸方程為y=1.1688x+0.0054,決定系數R2=0.9998,具有良好線性關系,x為蘆丁標準液濃度(mg·mL-1)。

樣品的測定:準確量取景天三七總黃酮粗提物樣品液1 mL。按上述方法測定吸光度,并帶入標準曲線方程計算,得出總黃酮含量。

1.2.4 大孔樹脂靜態吸附-解吸附實驗

1.2.4.1 大孔樹脂篩選 將預處理好的四種大孔樹脂(D101型、DA-201型、X-5型、AB-8型)抽濾并經濾紙吸干后,各精確稱取1.0 g于200 mL錐形瓶中,再準確加入一定濃度的景天三七總黃酮樣品液25 mL。于30 ℃、振蕩頻率100 r/min的條件下振蕩吸附24 h后,測定平衡液總黃酮濃度Ce。分別抽濾后,將大孔樹脂移回錐形瓶中,準確加入25 mL 95%乙醇,再在30 ℃、振蕩頻率100 r/min的條件下振蕩靜態解吸附24 h后,測定解吸液總黃酮濃度Cd。通過比較吸附率、解吸率和回收率,篩選出理想型大孔吸附樹脂。

1.2.4.2 大孔樹脂靜態吸附-解吸附動力學曲線 樹脂靜態吸附曲線:精確稱取篩選出的大孔吸附樹脂1.00 g于200 mL三角錐形瓶中,加入25.00 mL濃度為0.7 mg·mL-1的景天三七總黃酮純化液。在pH為4.0、30 ℃、振蕩頻率100 r/min的條件下振蕩靜態吸附7 h,每隔30 min取0.2 mL上清液測定總黃酮濃度計算吸附率,建立吸附率與時間的靜態吸附動力曲線。

樹脂靜態解吸附曲線:將上述已經吸附飽和的大孔吸附樹脂抽濾并用濾紙吸干后轉移到200 mL三角錐形瓶中,加入95%乙醇25 mL,在pH為4.0、30 ℃、振蕩頻率100 r/min的條件下振蕩靜態解吸附7 h,每隔30 min取0.2 mL上清液測定總黃酮濃度并計算解吸率,建立解吸率與時間的靜態解吸附動力學曲線。

1.2.4.3 大孔樹脂靜態吸附及解吸附條件優化 使用篩選出的DA-201依照方法1.2.4.1及1.2.4.2進行靜態吸附和靜態解吸附實驗,研究樹脂靜態吸附和解吸附動力學,考察樣液質量濃度(0.1、0.3、0.7、1.4、2.8 mg/mL,pH為4.0)和pH(2、3、4、5、6,樣液質量濃度為0.7 mg/mL)對靜態吸附的影響,乙醇濃度(75%、80%、85%、90%、95%,pH為4.0,樣液質量濃度為0.7 mg/mL)對靜態解吸附的影響。實驗均重復三次取平均值。

1.2.4.4 樹脂吸附率及解吸率的計算 吸附量(Q)、吸附率(E)、解吸率(D)、回收率(R)分別按照如下公式計算[21]。

式(1)

式(2)

式(3)

式(4)

式中:C0-溶液總黃酮起始濃度,mg·mL-1;Ce-溶液平衡時黃酮濃度,mg·mL-1;V0-吸附液體積,mL;m-樹脂質量,g;Cd-解吸液黃酮濃度,mg·mL-1;Vd-解吸液體積,mL。

1.2.5 景天三七總黃酮抗氧化活性測定

1.2.5.1 景天三七精提液樣品的制備 按1.2.4優化試驗得到的DA-201型樹脂純化分離條件處理景天三七總黃酮樣品液,收集洗脫液,離心(4500 r/min,15 min,25 ℃),濃縮除醇,進行預凍過夜(0 ℃)后置于真空冷凍干燥機中干燥36 h得景天三七精提物總黃酮粉末。按照方法1.2.1配制成景天三七精提物溶液,比較純化前后的黃酮純度和抗氧化活性。

1.2.5.2 總黃酮純度的測定 總黃酮溶液理論濃度值為1.00 mg·mL-1(P2),測定粗提物及精提物液樣品純度(P1),計算含量。按式(5)計算含量(P)。

式(5)

式中:P1-溶液實際濃度,mg·mL-1;P2-溶液理論濃度,mg·mL-1。

1.2.5.3 DPPH·清除作用測定 參考Helal等[22]對DPPH·清除率測定方法,于517 nm下測定吸光值,按下式(6)計算DPPH·清除率(K)。以VC作為陽性對照。

式(6)

式中:Ai-加入樣品溶液吸光值;Aj-樣品溶液本底吸光值;Ac-空白吸光值。

1.2.5.4 ABTS+·清除活性 以過硫酸鉀溶液配制ABTS+儲備液,并以磷酸鹽緩沖液稀釋得到ABTS+·測定液,參照Binsan等[23]的方法,按下式(7)計算ABTS+·自由基清除率。以VC作為陽性對照。

式(7)

式中:Ai-加入樣品溶液吸光值;Aj-樣品溶液本底吸光值;Ac-空白吸光值。

1.2.5.5 對羥基自由基清除作用測定 參照薛丁萍等[24]對羥自由基的測定方法,按下式(8)計算羥自由基清除率(R)。以VC作為陽性對照。

式(8)

式中:Ai-加入樣品溶液吸光值;Aj-樣品溶液本底吸光值;Ac-空白吸光值。

1.2.6 景天三七總黃酮純化物初步鑒定

1.2.6.1 紫外-可見光譜掃描 用紫外可見分光光度計,于250～600 nm波長范圍內對景天三七總黃酮純化液進行紫外-可見光譜掃描分析。

1.2.6.2 紅外光譜掃描 取適量景天三七總黃酮純化物粉末,與適量的溴化鉀研磨混合后壓片,在400～4000 cm-1范圍內進行紅外光譜掃描。

1.2.6.3 顏色反應 采用鹽酸-鋅粉反應、四氫硼鈉反應、鋁鹽反應、鎂鹽反應、與濃硫酸反應[25],觀察并記錄顏色,對景天三七總黃酮的種類進行初步鑒定。

1.2.6.4 HPLC-MS分析 供試品溶液制備:取景天三七精提物總黃酮粉末0.1 g,置50 mL容量瓶中,加入70%乙醇40 mL,超聲處理30 min,放至室溫,用70%乙醇定容。搖勻后取適量離心5 min(12000 r/min),取上清液,即得。

色譜條件:色譜柱為ZorbaxEclipseXDB-C18(4.6×250 mm,5 μm);柱溫40 ℃;進樣量50 μL;檢測波長270 nm;流速0.63 mL/min。流動相A:水;流動相B:甲醇。洗脫程序:0 min,0 A;5 min,20% A;10 min,40% A;15 min,80% A;20 min,95% A。質譜條件:采用ESI源,負離子模式,離子掃描范圍0～1000 m/z;霧化氣壓力:207 kPa;干燥氣流速:10 L/min;干燥氣溫度:325 ℃;TrapICC:30,000 units;最大累計時間:300 ms;MS誘導碰撞能量為1.0 V。

1.3 數據處理

實驗均平行重復3次,采用Excel,SPSS 23軟件進行數據統計分析,使用Origin 8.5處理數據和繪圖;紅外、紫外、色譜圖、質譜圖由儀器自帶系統給出。

2 結果與分析

2.1 大孔樹脂對景天三七總黃酮靜態吸附解吸優化

2.1.1 大孔樹脂篩選 在相同靜態吸附試驗條件下,測得各樹脂對景天三七總黃酮的靜態吸附-解吸附結果如表1所示。

表1 不同大孔吸附樹脂對景天三七總黃酮靜態吸附和解吸結果Table 1 Static adsorption and desorption of total flavonoids from different macroporous

通常對大孔樹脂吸附作用影響較大的因素有極性、樹脂孔徑、比表面積等。由表1可知,所選取的4種大孔樹脂對景天三七總黃酮均有一定的吸附量,且相互之間差異性顯著(p<0.05),DA-201的吸附量、吸附率、解吸率、回收率均高于其它類型樹脂。推測所選樹脂的極性和目標物極性越相近,DA-201屬于極性共聚體,與黃酮類化合物極性相似,因此其具有較強的吸附能力。雖然X-5和AB-8型樹脂孔徑和比表面積大更有利于解吸過程,但可能因其極性原因,其吸附率較DA-201型低。綜合各方面因素,最終選用DA-201型大孔樹脂作進一步研究。

2.1.2 大孔樹脂靜態吸附-解吸附動力學曲線 由圖1、圖2可知,DA-201型大孔樹脂的吸附率和解吸率在對景天三七總黃酮的吸附-解吸附的過程中,隨時間的增加而分別相應增長,吸附率在1 h后維持在相對平穩的狀態,解吸附率在3 h后趨于平穩,所以從實際生產的角度考慮,1 h為最適宜吸附時間,3 h為最適宜的解吸附時間。

圖1 DA-201樹脂靜態吸附動力學曲線Fig.1 Static adsorption kinetic curve of DA-201 resin

圖2 DA-201樹脂靜態解吸附動力學曲線Fig.2 Static desorption kinetic curve of DA-201 resin

2.1.3 樣液質量濃度對DA-201樹脂吸附率的影響 由圖3可知,DA-201樹脂吸附率隨樣液質量濃度的升高不斷提升,但在樣液質量濃度增加至0.7 mg/mL后,上升趨勢近于平穩。在樣液濃度較低時,樣液中的黃酮分子和DA-201樹脂的接觸幾率較小,所以吸附率低;當樣液質量濃度持續增加后,DA-201樹脂的孔徑已經處于填充飽和狀態,繼續提升樣液質量濃度對其吸附率起不到提升作用。考慮吸附效率,所以樣液質量濃度選用0.7 mg/mL為宜。

圖3 樣液質量濃度對DA-201樹脂吸附率的影響Fig.3 Effect of mass concentration of liquid sample on adsorption rate of DA-201 resin

2.1.4 樣液pH對DA-201樹脂吸附率的影響 由圖4可知,隨樣液pH的升高,DA-201樹脂吸附率逐漸降低,在pH為2～3時吸附率呈緩慢下降趨勢。依據大孔樹脂的吸附原理,樣液pH應當接近吸附目標物的酸堿度時,吸附效果最好,但pH過低時易對黃酮類化合物產生破壞作用,導致分解變性等。因此雖然黃酮類化合物多為酸性或弱酸性的酚類物質,但實際采用pH=3為最佳條件。

圖4 樣液pH對DA-201樹脂吸附率的影響Fig.4 Effect of sample solution pH on adsorption rate of DA-201 resin

2.1.5 乙醇濃度對樹脂靜態解吸附的影響 由圖5可知,當乙醇濃度為90%時,景天三七總黃酮的解吸率達到最高。因為黃酮類化合物多易溶于乙醇,乙醇濃度越高,黃酮類物質溶解程度越高,但由于有解吸液中其余醇溶性雜質的存在,當乙醇濃度過高會導致其雜質解吸增多,降低黃酮類化合物的吸附率。故乙醇濃度選擇90%為宜。

圖5 乙醇濃度對DA-201樹脂解吸率的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on the desorption rate of DA-201 resin

2.2 景天三七總黃酮純化前后的抗氧化活性

對景天三七總黃酮經DA-201型大孔樹脂純化前后的總黃酮純度進行對比,并通過IC50(50%清除率)作為評價標準對ABTS清除率、羥自由基、DPPH清除率三個指標進行純化前后的體外抗氧化能力對比分析。IC50值可通過SPSS 23軟件對圖6中的清除率曲線進行回歸分析擬合處理,結果見表2。由表2可知,經DA-201型大孔樹脂純化后,總黃酮的純度由19.38%提高到43.78%,景天三七總黃酮純度提升了2.26倍,且羥自由基、DPPH清除率的IC50均低于純化前,IC50值越低,說明樣品抗氧化性越強。單方方等人[26]在對牡丹葉的黃酮類化合物純化對抗氧化能力影響研究時,同樣發現黃酮純度越高抗氧化效果越明顯。所以DA-201型大孔樹脂對景天三七總黃酮純化效果整體突出,較大程度上提升了景天三七總黃酮的純度和體外抗氧化活性,可以為下一步的景天三七總黃酮性質研究提供適宜樣品。

表2 純化前后景天三七總黃酮純度、體外抗氧化能力比較Table 2 Comparison of purity and antioxidant capacity of total flavones of Sedum aizoon before and after purification

圖6 景天三七總黃酮體外抗氧化作用Fig.6 Antioxidant activity of total flavonoids from Sedum aizoon in vitro注:(a)～(c)分別為ABTS自由基清除率、 羥自由基清除率和DPPH自由基清除率。

2.3 景天三七總黃酮性質初步鑒定

2.3.1 紫外可見吸收光譜分析 通常大多數黃酮類化合物的紫外可見吸收光譜由峰帶I(300～350 nm,產生于黃酮類化合物基本結構中的環苯甲酰系統)和峰帶II(350～400 nm,產生于黃酮類化合物基本結構中的環肉桂酰系統)兩部分組成。)對樣品溶液在250～600 nm波長范圍內進行紫外-可見光譜掃描。結果如圖7所示,景天三七總黃酮的吸收波長主要分為兩個吸收帶,峰帶I的吸收峰在350～390 nm間,峰帶II的吸收峰位于270 nm,符合黃酮醇類化合物吸收峰帶的特征,峰帶II的吸收峰強度明顯強于峰帶I,并且峰帶I峰型較寬、平緩,可能是因為環苯甲酰系統上取代基成分種類較多。

圖7 景天三七總黃酮的紫外-可見吸收光譜圖Fig.7 UV Vis absorption spectra of total flavonoids from Sedum aizoon

2.3.2 紅外可見吸收光譜分析 由圖8可知,費總黃酮樣品和蘆丁在400～4000 cm-1范圍內出現多處波峰。其中,標準品蘆丁在3427 cm-1和樣品在3432 cm-1處的寬大且強度極高的吸收峰均為游離O-H伸縮振動的吸收峰,說明了酚羥基的存在;蘆丁標準品的2935 cm-1和樣品的2920 cm-1,為-CH2的反對稱伸縮振動峰[27];在1650～1450 cm-1區,是蘆丁的苯環骨架震動特征吸收峰分布區域,此處景天三七總黃酮樣品和蘆丁一致具有三個吸收峰,可推測樣品可能有苯環的存在;在1500～1300-1cm-1處,蘆丁和樣品都出現一定特征峰,這是O-H的面內彎曲振動峰;C-O的伸縮振動吸收峰位是1300～1200 cm-1,蘆丁和樣品在此區域都有相應的特征峰;蘆丁和樣品位于573 cm-1處的吸收峰是苯環上的取代基引起的,樣品此處的吸收峰強度低于蘆丁標準品,表明羥基取代位置不同[28]。依據上述基于吸收譜帶的位置及對官能團推測的信息,景天三七總黃酮與蘆丁的紅外光譜有多處相似,初步判斷景天三七總黃酮可能為黃酮醇,但具體的結構還需要進一步的研究與探索。

圖8 景天三七總黃酮和標準品蘆丁的紅外光譜圖Fig.8 Infrared spectrum of total flavones and standard Rutin of Sedum aizoon

2.3.3 顏色反應鑒定分析 對純化后的景天三七總黃酮進行顏色反應,結果見表3。通過顏色反應結果,結合文獻[29]報道,對景天三七總黃酮的性質進行進一步鑒定分析,初步推測為黃酮醇類化合物。

表3 景天三七總黃酮顏色反應結果及分析Table 3 Results and analysis of the color reaction of the total flavonoids of Sedum aizoon

此結果也與紫外-可見光譜掃描和紅外光譜掃描的結果一致。

2.3.4 HPLC-MS信息分析 由于純化后的樣品是仍含有一部分雜質的混合物,且成分復雜未知,對質譜信息造成一定的干擾,本研究決定采用低分辨質譜儀對純化后的樣品進行初步的物質推測,以期為后續景天三七黃酮類化合物分級分離定性研究作一定參考。

如圖9總離子流圖,各峰分離效果較好,對其中主要的6個峰的質譜信息進行推斷,依據特征碎片離子峰的質荷比結合文獻報道的黃酮類化合物信息[30-31],從而可以初步推測樣品中可能含有的黃酮化合物,結果如表4所示,可能主要存在的黃酮類化合物有蕓香糖苷、水飛薊素類、蘆丁類、金絲桃苷類、山奈酚-3-O-糖苷類、槲皮素-3-O-糖苷類。

圖9 景天三七純化后總黃酮樣品負總離子流色譜圖Fig.9 Total negative ion chromatograms of total flavonoids after purification

圖10 代表化合物的質譜圖Fig.10 Mass spectrum of the represents compound 注:圖(a)～(f)分別為1～6代表化合物一級質譜圖。

表4 代表化合物質譜數據Table 4 Mass spectrometry data representative compound

3 結論

通過靜態吸附解吸附實驗,篩選出DA-201型大孔吸附樹脂為最佳樹脂類型,且獲得DA-201型大孔吸附樹脂最佳靜態吸附分離工藝參數為:吸附時間3 h,樣液質量濃度為0.7 mg/mL,上樣液pH為3.0,解吸附乙醇濃度為90%。在該條件下靜態吸附率為81.05%,解吸附率為86.05%。純化后,總黃酮的純度由19.38%提高到43.78%,其羥自由基、DPPH清除率的IC50分別由69.47、44.02 μg/mL下降到43.25、30.16 μg/mL,純化后的純度和抗氧化能力明顯提升。通過紫外可見光譜、紅外光譜、顏色反應等一系列性質鑒定分析方法,初步推測本文所研究的純化后的景天三七總黃酮中可能含有蕓香糖苷、水飛薊素類、蘆丁、金絲桃苷類、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-糖苷類等化合物,具體的成分組成及結構分析有待進一步研究。