水酶法提取金耳多糖的工藝優化

, ,,,,*

(1.云南省供銷合作社科學研究所,云南昆明 650221; 2.云南大學農學院,云南昆明 650091)

金耳(Tremellaaurantialba),是異擔子菌綱(Heterobasi-diomycetes),銀耳目(Tremellales),銀耳科(Tremellaceae)的名貴食藥用真菌[1],又稱黃木耳、茂若色爾布(藏語)、黃耳、腦耳,自然分布于我國西藏、云南等地。金耳性甘、溫,具有清肺生津、化痰止咳、調氣定喘、平肝陽、補心養氣的功效[2]。金耳主要活性成分為金耳多糖,子實體多糖的主鏈為木糖和甘露糖,具有免疫增強、保肝、促進造血功能、抑制炎癥及潰瘍、抗輻射、抗衰老等作用[3]。

金耳子實體多糖的分子量較大,約300～500 kD[3],常規提取工序中易產生大量泡沫,提取分離困難,不利于云南地區豐富金耳資源的開發。目前金耳多糖提取方法主要有水提取[4]、超聲波提取[5-7]、微波提取[8]、酶法提取[9]等,其中利用酶法輔助提取金耳多糖的方法具有節能環保、可減少高溫及超聲對活性成分的影響、更高得率等優勢。纖維素酶、果膠酶為最為常用提取用酶,溫和的酶處理條件在提高提取物的品質、提取率以及提高副產物質量等方面存在優勢[10-15],水酶法在植物油提取方面的研究和應用也越來越廣泛。

水酶法提取金耳多糖相關工藝研究報道較少,影響多糖得率的主要因素有酶添加量、提取溫度、提取液料比、提取時間、粒徑等[4,14],本試驗采用響應面分析法研究纖維素酶及果膠復合酶添加量、提取溫度、提取液料比、提取時間及粒徑因素對提取金耳多糖得率的影響,擬獲得水酶法提取金耳子實體多糖最佳提取工藝,為金耳多糖提取開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金耳子實體干品 由昆明食用菌研究所提供;濃硫酸、苯酚 分析純,國藥集團化學試劑有限公司;D-無水葡萄糖 純度99.9%,中國食品藥品檢定研究院;纖維素酶,臺州海松化工產品有限公司;果膠酶 食品級,酶活105U/g,蘇柯漢(澳資)生物工程有限公司。

J-301型低溫超速離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司;SPECORD? 200 PLUS型分光光度計 德國耶拿分析儀器股份公司;ME204/02型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;DGF-80型粉碎機 滄州方圓公路建筑儀器廠;HH.S21-8型數顯電熱恒溫水浴鍋 杭州科曉化工儀器設備有限公司;OKP-S0標準通用型超純水機 上海淶科儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 金耳多糖的制備 將金耳子實體切碎后于60 ℃烘干,冷卻至室溫后用粉碎機粉碎,過一定目數的樣品篩得到金耳粉。稱取一定質量的金耳粉,加5倍體積的80%乙醇在80 ℃水浴條件下進行回流去脂2 h,然后抽濾、烘干得到脫脂金耳粉。準確稱取一定量的脫脂金耳粉,加入蒸餾水和一定比例的纖維素酶及果膠酶后進行提取。提取完成后10000 r/min離心10 min取上清液,將上清液濃縮至一定體積后加入4倍體積的無水乙醇靜置過夜。10000 r/min離心10 min后得到沉淀,再用適量丙酮洗滌后-80 ℃冰箱預冷凍24 h,冷凍干燥24 h即為金耳粗多糖[16]。

1.2.2 多糖得率的計算 以D-無水葡萄糖標準品為標準,采用苯酚-硫酸法[17]測定金耳多糖的濃度。

1.2.2.1 葡萄糖標準方程的建立 苯酚-硫酸法建立標準方程:準確稱取10 mg干燥的D-無水葡萄糖溶解,在250 mL的容量瓶中定容。分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL標準葡萄糖溶液,以蒸餾水補充至2 mL,加入1 mL 6%的苯酚及5 mL濃硫酸,冷卻至室溫后在490 nm處測吸光度。取2 mL的蒸餾水按同樣的步驟作為空白對照。以葡萄糖溶液的質量濃度(mg/mL)為橫坐標,吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.2.2 金耳多糖得率的計算 將冷凍干燥之后獲得的金耳多糖40 mg用200 mL蒸餾水溶解后,量取2 mL金耳多糖溶液按照1.2.2.1的苯酚-硫酸法在490 nm處測定金耳多糖溶液的吸光度,參照標準方程計算金耳多糖的濃度,依據式(1)計算金耳多糖的得率(W)。

式(1)

式中:w-金耳多糖的得率(%);c-檢測樣品溶液的濃度(mg/mL);v-檢測樣品溶液的體積(mL);m-金耳粉的質量(mg)。

1.2.3 復合酶比例的確定 稱取粉碎至60目的金耳粉1 g,液料比為100∶1 (mL/g),提取溫度為50 ℃,提取時間為30 min的條件下探究果膠酶與纖維素酶不同比例(2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2)對金耳多糖得率的影響,通過復合酶添加量預實驗優選果膠酶與纖維素酶添加量為20 mg。

1.2.4 單因素實驗 分別以不同的復合酶添加量、提取時間、提取溫度、液料比、粒徑為單因素[4,14]進行試驗,探究各因素對金耳多糖得率的影響。

1.2.4.1 復合酶添加量 稱取粉碎至60目的金耳粉1 g,液料比為100∶1 (mL/g),提取溫度為50 ℃,提取時間為30 min的條件下探究不同果膠酶與纖維素酶復合酶添加量(5、10、15、20、25、30 mg)對金耳多糖得率的影響。

1.2.4.2 提取時間 稱取粉碎至60目的金耳粉1 g,液料比為100∶1 (mL/g),提取溫度為50 ℃,復合酶添加量為20 mg的條件下探究不同提取時間(10、20、30、40、50、60 min)對金耳多糖得率的影響。

1.2.4.3 提取溫度 稱取粉碎至60目的金耳粉1 g,液料比為100∶1 (mL/g),復合酶添加量為20 mg,提取時間為30 min的條件下探究不同提取溫度(40、45、50、55、60、65 ℃)對金耳多糖得率的影響。

1.2.4.4 液料比 稱取粉碎至60目的金耳粉1 g,復合酶添加量為20 mg,提取溫度為50 ℃,提取時間為30 min的條件下探究不同液料比(100∶1、200∶1、300∶1、400∶1、500∶1 mL/g)對金耳多糖得率的影響。

1.2.4.5 粒徑 分別稱取不同粒徑(40、60、80、100、120、140目)的金耳粉1 g,在液料比為100∶1 (mL/g),提取溫度為50 ℃,提取時間為30 min的條件下探究粒徑對金耳多糖得率的影響。

1.2.5 響應面試驗 根據單因素實驗的結果,選取液料比、提取時間、提取溫度、復合酶的添加量4因素為自變量,以金耳多糖的得率為響應值。采用Box-Behnken中心組合設計響應面試驗。試驗因素和水平見表1。

表1 響應面試驗因素與水平設計Table 1 Factors and levels in response surface design

1.3 數據統計分析

應用Excel 2010軟件統計數據及作圖,應用軟件Design Expert 8.0.5中Box-Behnken中心組合設計響應面試驗。并進行3次平行驗證試驗。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線

葡萄糖標準曲線方程:y=6.2328x+0.0232,R2=0.9914。其中y為490 nm處的吸光度,x為葡萄糖的質量濃度(mg/mL)。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

2.2 復合酶比例的確定

果膠酶與纖維素酶的不同復配比例(共20 mg/g)對金耳多糖得率的影響如圖2所示,隨著果膠酶與纖維素酶比例由2∶8升高至6∶4,金耳多糖得率隨之增加,但當果膠酶與纖維素酶比例由6∶4升高至8∶2,金耳多糖得率呈明顯下降趨勢,表明果膠酶與纖維素酶配比為6∶4時金耳多糖的得率最高,故后續實驗中,優選復合酶中果膠酶與纖維素酶復配比例為6∶4。

圖2 果膠酶與纖維素酶的配比對金耳多糖得率的影響Fig.2 Effect of the ratio of pectinase to cellulase on extraction rate of polysaccharide from Tremella aurantialba

2.3 單因素實驗

2.3.1 復合酶添加量對金耳多糖得率的影響 在復合酶添加量為20 mg/g時金耳多糖得率最高(圖3)。當復合酶添加量少于20 mg/g時,金耳多糖得率隨復合酶添加量增大而增大,但復合酶添加量多于20 mg/g時,金耳多糖得率基本恒定。分析其原因可能為復合酶添加量較少,金耳細胞壁在一定時間和一定接觸面條件下分解不完全,無法促進胞內多糖從細胞中全部釋放出來與溶劑直接接觸;隨著酶濃度的增加,相同時間內底物與酶充分作用,使反應速度加快,金耳多糖的得率從而迅速增加;而隨著酶濃度的繼續加大,酶開始處于飽和狀態,底物已經最大限度的與酶結合,導致酶的利用率降低,金耳多糖的得率不再明顯增加[16]。因此選擇的最適復合酶添加量為20 mg/g。

圖3 復合酶添加量對金耳多糖得率的影響Fig.3 Effect of enzyme addition on extraction rate of polysaccharide from Tremella aurantialba

2.3.2 提取時間對金耳多糖得率的影響 如圖4所示,當提取時間小于50 min時,隨著提取時間的延長,金耳多糖的得率迅速增加,當提取時間超過50 min時得率增加趨于平緩,隨著提取時間的增長,得率不再升高。分析原因可能是提取時間在50 min之前,隨著提取時間的延長金耳多糖可以更充分的溶出,提高金耳多糖的得率,但提取時間超過50 min后無法繼續溶出更多的多糖導致金耳多糖的得率不再升高。因此選擇最適的提取時間為50 min。

圖4 提取時間對金耳多糖得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of polysaccharide from Tremella aurantialba

2.3.3 提取溫度對金耳多糖得率的影響 如圖5所示,在溫度為50 ℃時金耳多糖的得率達到最高,可能由于此溫度是果膠酶與纖維素酶在提取條件下的最適溫度[18]。因此當溫度高于或低于50 ℃時均對復合酶產生抑制作用導致金耳多糖的得率降低。因此,選擇金耳多糖提取的最佳溫度為50 ℃。

圖5 提取溫度對金耳多糖得率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on extraction rate of polysaccharide from Tremella aurantialba

2.3.4 提取液料比對金耳多糖得率的影響 如圖6所示,在液料比為100∶1～300∶1 (mL/g)時多糖得率上升隨著液體體積的增加而明顯增加,在液料比為300∶1 (mL/g)時多糖得率達到最高,當液料比繼續增加時,多糖得率變化并不明顯。分析原因可能是當液體比較少時,不利于多糖的溶出,使得得率較低,而當液體體積過大時,酶濃度降低導致酶的作用下降,且多糖成分已溶出充分,因此得率會趨于恒定甚至下降[16]。因此選取最適液料比300∶1 (mL/g)。

圖6 液料比對金耳多糖得率的影響Fig.6 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of polysaccharide from Tremella aurantialba

2.3.5 粒徑對金耳多糖得率的影響 如圖7所示,隨著粒徑的減小,多糖的得率逐步提高,在120目時達到最大值,120目多糖得率較40目僅提高1.38%,即粒徑對得率的影響不明顯。綜合考慮,后續響應面實驗不以粒徑為自變量進行實驗設計。

圖7 粒徑對金耳多糖得率的影響Fig.7 Effect of grain size on extraction rate of polysaccharide from Tremella aurantialba

2.4 響應面試驗結果及數據分析

2.4.1 響應面實驗設計方案及結果 根據單因素實驗結果,由Design Expert 8.0.5統計分析軟件設計出的實驗方案及實驗結果如表2所示,以金耳多糖的得率為響應值,以液料比(A)、提取時間(B)、提取溫度(C)、復合酶的添加量(D)為自變量,建立四因素三水平中心組合實驗設計共計包括29個實驗方案,其中24個析因實驗點,5個中心實驗點,用以計算實驗誤差。

表2 Box-Benhnken響應面試驗結果Table 2 Results of Box-Benhnken experiment

由表3可知,模型項極顯著(p<0.0001),失擬項不顯著,表明該方程對試驗擬合情況好,試驗誤差小。回歸方程較好地描述了各因素與響應值之間的真實關系。因此,可以用該回歸方程代替試驗真實點對試驗結果進行分析。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

結果表明,液料比(A)、提取時間(B)、液料比二次項(A2)、提取時間二次項(B2)、提取溫度二次項(C2)對響應值影響極顯著(p<0.01),提取溫度(C)、液料比提取時間(AB)、復合酶的添加量二次方(D2)對響應值影響顯著(p<0.05);各因素對響應值顯著性的排序為A>B>C>D。由該回歸方程確定出最佳提取工藝條件為:液料比為347.38∶1 (mL/g),提取時間為52.71 min,提取溫度為52.32 ℃,復合酶添加量為20.79 mg/g,此時金耳多糖得率理論值12.78%。

2.4.3 響應面圖分析 根據軟件Design-Expert獲得響應值的3D曲面,分析各因素對金耳多糖得率的影響及各因素間的交互作用,當固定液料比、提取時間、提取溫度、復合酶的添加量中任意兩個因素為零水平時,其余兩個因素間的交互作用對多糖得率的影響。如圖8,多糖得率隨其中任意兩個變量的增加均呈上升趨勢,

圖8 各因素的交互作用對多糖得率的響應面圖Fig.8 Response surface plots of variable parameters on the yield of polysaccharides from Tremella aurantialba

達到一定值時,曲面稍下降或趨于平緩。由圖8a、圖8b、圖8d可以看出液料比相對于浸提時間、提取溫度而言復合酶添加量對多糖得率的影響較大,與方差分析結果相符。

2.4.4 驗證試驗 由回歸方程確定出最佳提取工藝條件為:液料比為347.38∶1 (mL/g),提取時間為52.71 min,提取溫度為52.32 ℃,復合酶添加量為20.79 mg/g,此時金耳多糖得率理論值12.78%。為方便試驗的實際操作,將最佳提取條件調整為液料比為347∶1 (mL/g),提取時間52 min,提取溫度為52 ℃,復合酶添加量為20.50 mg/g,進行3次平行驗證試驗,在此條件下金耳多糖的得率平均值為12.69%±0.52%。驗證試驗結果表明,經過相應面回歸方程擬合出的理論值與實際值相吻合,驗證了方程的可靠性。

3 結論

本試驗采用酶法輔助提取技術提取金耳中的多糖,以液料比、提取時間、提取溫度、復合酶添加量為單因素,以金耳多糖得率為響應值,采用Box-Behnken中心組合設計響應面試驗設計,得到酶法輔助提取金耳多糖的最佳工藝條件為液料比為347∶1 (mL/g),提取時間52 min,提取溫度為52 ℃,復合酶添加量為20.50 mg/g,在此條件下金耳多糖的得率為12.69%±0.52%。

通過研究可知,酶輔助法提取[9]較水提取法、超聲波提取法、微波提取法有較大的優勢,提取溫度較低,提取時間短,且得率較高,節能環保、可減少高溫及超聲對活性成分的影響[10-15]。故該方法為金耳多糖的一種較理想的提取方法,研究結果可為金耳多糖的提取及開發研究提供依據,具有一定的實際應用前景。