無機鹽對湖北花楸葉多糖醇沉效率 及其抗氧化性的影響

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(1.西北農林科技大學風景園林藝術學院,陜西楊凌 712100; 2.西北農林科技大學林學院,陜西楊凌 712100)

湖北花楸(SorbushupehensisC. K. Schneid.)為花楸屬植物,為落葉喬木或灌木。我國有 50 余種花楸屬植物,產于西南、西北以及東北地區。該屬植物具有重要的經濟價值,密集的花序可使其作園林觀賞植物,其中部分種類植物是果樹育種和砧木的重要原料,種子油用于肥皂及醫藥工業,樹皮用于鞣皮工業中[1-2]。研究發現,該屬植物中含有較豐富的黃酮、花青素、雙聯苯酚、類山梨酸苷、生氰苷等成分,并在藥理作用上具有強抗氧化、抗癌、抗輻射和止咳平喘等作用,引起了國內外的廣泛關注[3-6]。關于湖北花楸葉中所含的多糖的研究目前尚未見報道。

植物多糖具有一定的生物活性,具有免疫調節、抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗菌抗病毒、保護肝臟等保健作用[7]。植物中多糖提取方法包括水提法、酸堿提法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、等多種方法[8-10],這些提取方法所提多糖都需要進一步的純化。多糖的純化方法有鹽析法、乙醇沉淀法、柱層析法、超濾法,其中乙醇沉淀法運用最為廣泛[11]。乙醇沉淀法利用多糖能溶于乙醇而雜質不溶于乙醇的特性,在加入乙醇后,有效成分轉溶于乙醇中,而雜質則被沉淀出來。此法雖能提取出大量的多糖,但是往往存在醇沉不徹底的缺點,致使原料利用率低下,其次,醇沉的過程大多需要過夜,存在耗時較長的問題。在水和有機溶劑的混合溶液中,加入一定量的無機鹽可改變水相的極性,提高兩相中的化合物分離效果,這一過程與鹽析的原理相似。如果這一原理運用于多糖的醇沉過程,將大大提升其提取效率[12]。針對在提取多糖的醇沉過程中存在的以上問題,本文以湖北花楸葉多糖為對象,研究添加無機鹽對其醇沉特性的影響,通過探索其醇沉規律來縮短醇沉時間,提高提取效率,同時為其他植物多糖提取的醇沉過程提供參考思路。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

湖北花楸葉 采集于秦嶺火地塘,風干,-20 ℃保存;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼 北京中生瑞泰科技有限公司;抗壞血酸 美國Sigma公司;無水乙醇、Na2SO4、(NH3)2SO4、NaCl、葡萄糖、苯酚、濃硫酸、K3[Fe(CN)6]、三氯乙酸、FeCl3、FeSO4、水楊酸 均購于科密歐化學試劑公司。

TU-19紫外光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;FA1204B電子分析天平 上海天平儀器廠;R213B旋轉薄膜蒸發儀 上海申生科技有限公司;FX超聲波清洗儀 濟寧豐鑫超聲設備有限公司;SHB-3循環真空泵 上海申生可以有限公司;索氏提取器 蜀牛玻璃儀器有限公司;C-MAG MS4磁力攪拌器 上海精密儀器儀表有限公司;TGL-16M冷凍離心機 湘儀離心機儀器有限公司;WJX-200高速多功能粉碎機 上海緣沃工貿公司;FD8-3T立式冷凍干燥機 GOLD-SIM公司;TENSOR II傅里葉變換近紅外光譜儀 德國Bruker Optics公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 花楸葉的預處理 將湖北花楸葉烘干(55 ℃,72 h),粉碎,過60目篩,然后用石油醚(沸程60～90 ℃)脫脂8 h,得脫脂花楸葉粉末,保存備用。

1.2.2 花楸葉多糖提取液的制備 精準1.00 g脫脂的花楸葉粉末于錐形瓶中,超聲波輔助水熱提取,提取條件為:料液比1∶30 (g/mL),超聲時間40 min,超聲功率350 W,提取溫度60 ℃[13]。抽濾提取液,上清液于40 ℃,0.1 MPa下旋轉蒸發濃縮至原體積五分之一,濃縮液于4 ℃下可經過醇沉后得到多糖。

1.2.3 花楸葉多糖含量的測定 采用苯酚-硫酸法測定花楸葉中多糖含量[14],以葡萄糖為標準品,于490 nm處測定吸光值,以葡萄糖質量濃度為橫坐標x(mg/mL),吸光值Y為縱坐標,繪制標準曲線,得到標準曲線方程為:Y=16.64x-0.0124(R2=0.9992)。

多糖得率的計算公式如下:

多糖得率(%)=花楸葉提取液中多糖質量×100/原料質量

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 無機鹽種類及濃度對多糖醇沉特性的影響 選取三種不同種類的無機鹽(NH3)2SO4、Na2SO4、NaCl)在其濃度(1.2%、1.6%、2.0%、2.4%、2.8%),加入4倍體積無水乙醇,醇沉24 h,過濾得所提多糖,測定多糖得率。

1.2.4.2 乙醇體積倍數對加鹽后醇沉特性的影響 取所制備的提取濃縮液,添加2、3、4、5、6倍體積的乙醇和2.4%的Na2SO4,醇沉24 h,過濾得所提多糖,測定多糖得率。

1.2.4.3 醇沉時間對加鹽后醇沉特性的影響 取所制備的提取濃縮液,添加4倍體積的乙醇和2.4%的Na2SO4,分別醇沉2、6、12、24 h,過濾得所提多糖,測定多糖得率。

1.2.5 正交試驗 在單因素實驗的基礎上,考察Na2SO4濃度A、醇沉時間B、醇沉體積C對多糖得率的影響,并采用三因素三水平L9(33)正交試驗,來確定提高多糖得率的最佳條件,并在最佳條件下進行多糖得率驗證試驗。

表1 正交試驗的因素水平表Table 1 Factors and levelsTable of orthogonal array test

1.2.6 紅外表征 將超聲提取醇沉的多糖溶液與加入2% Na2SO4醇沉的所得多糖溶液倒入分子量為5000和10000 Da半透膜中,透析出無機鹽,截留得到不同分子量大小的多糖,純化后將溶液冷凍干燥[15]。采用KBr壓片法,在4000～400 cm-1范圍內進行紅外光譜掃描,檢測無機鹽的加入對醇沉多糖的結構是否有影響。

1.2.7 抗氧活性的測定

1.2.7.1 總抗氧化能力的測定 參照文獻[16]將2 mL不同濃度多糖溶液與1 mL PBS(pH=7.0)、1 mL 1% K3[Fe(CN)6]溶液置于50 ℃中水浴20 min,加入2.5 mL三氯乙酸均勻混合,6000 r/min離心15 min,取上清液2.5 mL,加入0.5 mL新配制的0.1% FeCl3溶液,混合均勻,于700 nm處測定吸光值。蒸餾水為空白對照,同等濃度維生素C為陽性對照。每個樣品三組重復,取平均值。

1.2.7.2 DPPH自由基清除能力的測定 參照文獻[17]的方法,將2 mL不同濃度的多糖溶液與2 mL 0.25 mmol/L DPPH-乙醇溶液混合,混勻后靜置30 min,以無水乙醇為參比,于517 nm處測定吸光值分別為A,維生素C為陽性對照。每個樣品三組重復,取平均值。樣品對DPPH自由基的清除率則為:

DPPH自由基清除率(%)=(A1-A2)×100/A1

其中:A1為加入多糖溶液反應后的A值,A2為蒸餾水代替多糖樣品液后的A值。

1.2.7.3 羥自由基清除能力的測定 參照文獻[18]的方法,將2 mL不同濃度多糖溶液,2 mL 6 mmol/L FeSO4溶液與2 mL 6 mmol/L H2O2溶液加入試管中,搖勻后靜置15 min,再加入2 mL 6 mmol/L水楊酸溶液,搖勻后靜置30 min,于510 nm處測定吸光值A,蒸餾水為空白對照,維生素C為陽性對照。每個樣品做三組重復,取平均值。樣品對羥自由基的清除率為:

羥自由基清除率(%)=[A0-(A1-A2)]×100/A0

其中:A0為不加多糖溶液的空白值,A1為加入多糖液反應后的A值,A2為不加水楊酸時溶液的A值。

1.3 數據處理

上述方法中多糖得率實驗每組重復三次,取平均值,采用Excel軟件作圖,多糖的紅外表征采用Origin8軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 無機鹽種類及濃度對多糖得率的影響 不同的無機鹽會對醇沉體系的相平衡造成不同的影響[12],因此添加不同種類無機鹽后多糖的醇沉效果定會存在差異。不同濃度的Na2SO4、NaCl、(NH3)2SO4進對多糖得率的影響如圖1所示。

圖1 無機鹽種類對醇沉過程的多糖得率的影響Fig.1 Effects of different kinds of inorganic salts on the yield of polysaccharide in the process of alcohol precipitation

多糖的提取液采用傳統的醇沉方法純化,其多糖得率為2.54%。由圖1看出,加入一定濃度范圍的三種無機鹽,均能夠一定程度上提高多糖的得率,其中,添加Na2SO4時多糖的得率提高最為明顯。當Na2SO4濃度為2.4%時,多糖的得率趨于穩定;當濃度過高時,多糖得率反而緩慢下降。當(NH4)2SO4濃度大于2%,NaCl濃度大于1.6%時,多糖的得率反而有較大幅度的減少。無機鹽濃度不同,對多糖得率影響也不相同,在一定的濃度內,多糖得率隨著無機鹽濃度的升高而升高,當無機鹽濃度達到一定數值時,多糖得率基本維持穩定。無機鹽濃度較低時,可能會與水結合形成鹽溶液,從而降低多糖與水結合的可能性,從而使得多糖醇沉效率提高,當無機鹽濃度達到一定數值時到飽和狀態,其對多糖醇沉影響不再明顯[12]。此外,過高的添加量會導致過高的成本,因此,本實驗選擇的無機鹽為Na2SO4,濃度為2.4%。

2.1.2 乙醇體積倍數對多糖得率的影響 乙醇體積倍數在醇沉過程中有重要的影響。適量的乙醇體積倍數可以使多糖在較低的成本下盡可能多地醇沉出來。不同體積倍數的無水乙醇對多糖醇沉效率影響很大。當無水乙醇的體積倍數為多糖溶液的2～4倍時,多糖得率呈升高趨勢;當無水乙醇的體積倍數為多糖溶液的4倍以上時,多糖得率基本穩定。原因可能為:當乙醇體積倍數過低時,果膠和其他水溶性色素溶解性好,從而影響了多糖在溶劑中的溶解,提取液中多糖含量低,提取效果差;當乙醇體積倍數過高時,溶液極性過低,不利于多糖溶解[12]。因此選擇無水乙醇添加倍數為多糖溶液的4倍進行后續實驗。

圖2 乙醇體積倍數對醇沉過程的多糖得率的影響Fig.2 Effect of different ethanol volume multiple on the yield of polysaccharide in alcohol precipitation process

2.1.3 醇沉時間對多糖得率的影響 醇沉時間對多糖醇沉過程影響極為重要,由于醇沉過程過長是醇沉法的一大弊端,也是影響醇沉效率的重要原因。優化醇沉時間將大大提升醇沉效率。

醇沉時間是影響多糖得率的另一個重要因素。當醇沉時間較短時,醇沉不徹底,多糖得率較低,延長醇沉時間可提升多糖得率[11]。圖3可以看出,隨著醇沉時間的增加,多糖得率有所提高;當超過12 h時,多糖得率基本穩定為7.00%。這表明,添加無機鹽后醇沉過程在12 h基本趨于平衡,因此醇沉時間選擇為12 h。

圖3 醇沉時間對醇沉過程的多糖得率的影響Fig.3 Effect of alcohol precipitation time on the yield of polysaccharide in alcohol precipitation process

2.2 正交試驗結果

由表2可知,不同處理條件對多糖提取得率的影響為:醇沉時間>乙醇體積倍數>Na2SO4濃度,說明醇沉時間對多糖得率的影響最為重要。同時,通過正交試驗得到多糖醇沉最佳處理體系為A1B2C3,即Na2SO4濃度為2.0%,醇沉時間12 h,加入無水乙醇體積為5倍。在該條件下進行多次驗證試驗,多糖得率為7.2%±0.12%,而相同提取條件下不添加Na2SO4多糖得率僅有2.54%,說明該條件能夠有效提高多糖得率。

表2 正交試驗設計及結果Table 2 Design and results of orthogonal test

2.3 紅外表征

花楸葉多糖冷凍干燥后得到淺褐色粉末,將粉末采用KBr壓片法制作紅外光譜,多糖的結構特征可以通過FT-IR光譜鑒定。IR圖譜顯示,在3420 cm-1附近的吸收峰是糖類分子間或分子內的O-H鍵伸縮振動,2928 cm-1附近的吸收峰為烷基的C-H鍵伸縮振動,這兩組峰均屬于多糖的特征吸收峰[20],四種花楸多糖均出現了典型的多糖特征峰,且各紅外光譜很相似,說明四種多糖的碳鏈骨架基本一致[21]。在光譜圖中,四種多糖均在3400 cm-1附近出現了較寬的吸收峰,是O-H伸縮振動的結果,表明多糖分子內和多糖分子間均存在氫鍵。在2930 cm-1附近的吸收峰為C-H的振動。1724 cm-1的吸收峰處為酯鍵羰基(-COOR)形成的伸縮振動,1612 cm-1附近為羧基的羰基C=O伸縮振動,1400～1200 cm-1處的吸收峰為C-H的變形振動,這些特征吸收峰均表明樣品為多聚糖組分,根據文獻初步判斷為低酯多糖[22]。1417 cm-1的峰是C-H變角振動峰。在1017 cm-1的吸收峰是糖苷鍵C-O-C非對稱伸縮振動,說明了多糖中都存在吡喃環構象。在895 cm-1處的吸收峰表明多糖中存在β-構型糖[20]。1530 cm-1附近處出現的峰是N-H變角振動的信號,表明這四種多糖的紅外光譜圖還具有酰胺結構的特征吸收峰,由此推斷透析得到的四種多糖很可能為氨基多糖[20];四種糖在1450～1200 cm-1之間出現的一些不太尖的峰是羧基伸縮振動引起的,是糖類化合物的特征峰;1073 cm-1附近處出現的強吸收峰是由C-O形成的伸縮振動區,該吸收峰是C-OH和吡喃環上的醚鍵C-O-C特征吸收峰,說明四種組分中都存在吡喃糖苷鍵;在916和785 cm-1處出現的微弱吸收峰表明β-型糖苷鍵的存在,表明多糖是吡喃型多糖[20]。

圖4 不同醇沉條件下的多糖紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectra of polysaccharides under different alcohol precipitation conditions 注:1:過5000分子量膜多糖;2:加Na2SO4過5000 分子量膜多糖;3:過10000分子量膜多糖; 4:加Na2SO4過10000分子量膜多糖。

2.4 抗氧化活性

2.4.1 總抗氧化性 Fe3+-TPTZ可被樣品中的多糖還原成Fe2+的形式,溶液顏色由無色變為淺藍色,在593 nm波長處有最大吸收,根據吸光值的大小可以計算出樣品的總抗氧化活性[23]。由圖5可知,在一定的濃度范圍內,多糖溶液的活性與VC相近,說明花楸多糖具有較好的抗氧化性,其抗氧化能力的不同與多糖的單糖組成、分子質量分布和結構等多種因素有關[20]。這說明醇沉中加入無機鹽后,所提多糖并沒有失去抗氧化活性。

圖5 多糖的總抗氧化能力Fig.5 Total antioxidant capacity of polysaccharides

2.4.2 DPPH自由基清除活性 DPPH自由基是一種穩定的自由基,甲醇溶液顯紫色,自由基清除劑能夠與DPPH的單電子被配對,在最大吸收波長處顏色變淺,吸光度也隨之變小[24]。DPPH自由基清除率越高,說明其抗氧化能力越大,以VC為對照,其抗氧化性如圖6所示。多糖濃度與DPPH自由基清除率基本呈線性關系,當多糖濃度到達2.0 mg/mL時,其DPPH自由基清除率達到了72.87%,這與文獻中報道的同濃度黃秋葵花多糖的DPPH自由基清除能力相似[22]。這說明醇沉加入無機鹽后,所提多糖具有較好的DPPH自由基清除能力。

圖6 多糖的DPPH自由基清除能力Fig.6 DPPH free radical scavenging ability of polysaccharide

2.4.3 羥自由基清除活性 羥基自由基的清除率能力也是多糖的抗氧化活性指標之一。由圖7可以看出,隨著多糖濃度的增加,其羥自由基清除率也隨之增高,當加入無機鹽的醇沉多糖濃度到達2 mg/mL時,其羥基自由基清除率達到了68.39%。與文獻報道的藜麥葉片多糖相比,花楸葉所提多糖的羥自由基清除能力較低[7,25],但這一結果仍能表明所提花楸葉多糖具有一定的抗氧化活性。

圖7 多糖的羥自由基清除能力Fig.7 Hydroxyl radical scavenging ability of polysaccharid

3 結論

利用超聲復合無機鹽提取的方法從湖北花楸葉中提取多糖,通過正交試驗的方法獲得最優工藝為:Na2SO4濃度為2.0%,醇沉時間為12 h,加入無水乙醇體積倍數為5倍。在該條件下進行多次驗證試驗,多糖得率為7.2%±0.12%,而不添加無機鹽的多糖得率2.54%,這說明添加無機鹽可以有效提高醇沉過程中的多糖得率。紅外光譜顯示,將提取的多糖經過不同分子量半透膜進行純化后,無機鹽的添加并沒有破壞多糖結構。且抗氧化活性實驗也表明,其抗氧化活性依舊很高。這種方法作為一種高效的醇沉方法,可以廣泛用于從植物材料中提取多糖,有較大的應用前景。