濃香型窖泥中高產細菌素乳酸菌的 鑒定及特性

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(四川理工學院生物工程學院,四川自貢 643000)

窖泥是酒體生香功能微生物的繁殖載體,常年處于低pH、高水分、高靜壓、兼性厭氧的窖池中,菌群與窖泥中營養成分進行相互作用和相互交換等,給窖泥微生物的生長繁殖提供了特殊的環境[1-2]。窖泥中的菌種資源比較豐富,不同學者從中分離得到能產生抗生素、淀粉酶、類細菌素、木糖醇等功能微生物[3]。

窖泥功能微生物主要是己酸菌、丁酸菌、甲烷菌等,唐瑞等[4]用窖泥中甲烷菌和己酸菌自然富集的程度來作為老窖泥的標志和窖泥質量優劣的標志。岳小青等[5]采用超濃縮己酸菌液制成的窖泥培養液,使窖泥中的功能微生物菌群得到激活和增加,顯著提高了原酒液中己酸乙酯的含量。陳興杰等[6]提出己酸菌、丁酸菌是窖泥混合菌群中的重要功能菌,對總有機酸和主要目標酸類成分的合成有貢獻。而窖泥中的乳酸菌未引起足夠的重視。濃香型白酒的主體香為己酸乙酯,如果料醅中的乳酸菌過多,將會產生過多的乳酸,進而生成乳酸乙酯較多,降低白酒的口感[7]。因此,研究窖池中乳酸菌代謝產物有助于工業微生物菌種資源的開發及應用。

據乳酸乙酯的生成途徑可知,控制白酒中的乳酸乙酯含量需從控制乳酸菌的生成以及降解生成的乳酸或乳酸乙酯等方面入手[8]。乳酸菌在發酵過程中能夠產生乳酸、乙酸、H2O2、細菌素等多種具有天然抑菌活性的代謝產物[9]。其中,細菌素是一些革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌在生長過程中產生的具有抗菌活性的蛋白質結構物質[10],大多數產細菌素的乳酸菌是從食品中分離出來的,因此被認為是安全的[11],本文研究的菌種是從濃香型白酒窖泥中篩選出來的具有高抑菌活性的乳酸菌,研究其生物學特性,推測細菌素對白酒窖泥中微生物的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳酸菌 分離自瀘州老窖的窖泥;大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、米曲霉、保加利亞乳桿菌等 由本實驗室-20 ℃保藏;蛋白胨、蛋白酶、牛肉膏等 北京奧博星生物技術有限責任公司;Nisin標準品 sigma公司;吐溫-80、Triton X-100、SDS、EDTA等 國藥集團化學試劑有限公司;其它藥品均為分析純;細菌基因組DNA提取試劑盒 天津普瑞思生物技術有限公司;MRS培養基:蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母膏5.0 g、檸檬酸氫二銨2.0 g、葡萄糖20.0 g、吐溫-80 1.0 mL、乙酸鈉5.0 g、磷酸氫二鉀2.0 g、硫酸鎂0.58 g、硫酸錳0.25 g、蒸餾水1 L,pH6.2～6.4;PDA培養基:馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 L,自然pH;YPD培養基:蛋白胨10 g,酵母膏10 g,葡萄糖10 g,蒸餾水1 L,自然pH;LB培養基:蛋白胨10 g,NaCl 10 g,酵母膏5 g,蒸餾水1 L。

PHS-3C酸度計 成都世紀方舟科技有限公司;C1000型PCR儀 伯樂生命醫學產品(上海)有限公司;Gene Genius型凝膠成像系統 英國Syngene公司;UV-2450分光光度計 日本Shi-madzu公司;3K30臺式高速冷凍離心機 美國 Sigma 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 高抑菌活性乳酸菌的篩選

1.2.1.1 指示菌菌懸液的制備 將大腸桿菌接種于LB液體培養基中,37 ℃ 180 r/min搖床培養 1 d,稀釋成106CFU/mL的指示菌菌懸液。

1.2.1.2 發酵上清液的制備 將菌株活化后,37 ℃靜置培養8 h,制成終濃度為106CFU/mL的乳酸菌種子液,按體積分數5%接種量將菌株種子液接種到MRS液體培養基中,37 ℃靜置培養24 h后,8000 r/min 4 ℃離心20 min,收集上清液,4 ℃保存待用。

1.2.1.3 抑菌試驗 采用雙層瓊脂擴散法[12]進行抑菌試驗,對課題組分離自白酒窖泥中的19株乳酸菌進行復篩。在無菌培養皿中倒入10 mL水瓊脂培養基,冷卻凝固后放上牛津杯,以體積分數7%接種量將指示菌菌懸液加入到冷卻至50 ℃的LB固體培養基中,混勻,傾倒于底層水瓊脂上,待其凝固后,取出牛津杯,即形成孔洞,在每個孔內加0.2 mL乳酸菌發酵上清液,4 ℃擴散30 min,37 ℃培養24 h。觀察培養孔周圍是否出現抑菌圈并用游標卡尺測量其直徑,篩選出抑菌圈直徑最大,即抑菌效果最強的菌株劃線保存。

1.2.2 乳酸菌所產抑菌物質的確定

1.2.2.1 酸的排除 乳酸菌在發酵過程中能夠產生乳酸、乙酸等對細菌有一定抑制作用。用 1 mol/L NaOH溶液將0.1 mol/L的乳酸、乙酸和鹽酸的pH調至與發酵上清液相同的pH(pH3.68),以未處理的上清液作對照,采用1.2.1.3方法進行抑菌實驗,檢測抑菌效果。

1.2.2.2 過氧化氫的排除 乳酸菌在代謝過程中產生的過氧化氫屬于強氧化劑,對細菌也有一定抑菌作用,將發酵上清液調至過氧化氫酶的最適pH7.3,將過氧化氫酶加入到發酵上清液中,使其終質量濃度為1 mg/mL,37 ℃水浴2 h后將pH調回3.68,以未作處理的發酵上清液作空白對照,采用1.2.1.3方案測試抑菌活性。

1.2.2.3 酶敏感性 用1 mol/L HCl或NaOH溶液將發酵上清液pH調至酶的最適pH(胃蛋白酶pH2.0,木瓜蛋白酶 pH5.5,蛋白酶K pH7.0,胰蛋白酶 pH8.1),按終質量濃度為1 mg/mL分別將胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K和胰蛋白酶加到發酵上清液中,37 ℃水浴2 h后,調回pH3.68,進行抑菌試驗,以未處理發酵上清液做空白對照。計算出殘余抑菌率[13],如式(1)。

殘余抑菌率(%)=實驗組抑菌圈直徑/對照組抑菌圈直徑×100

式(1)

1.2.3 一株高抑菌活性乳酸菌的鑒定

1.2.3.1 形態學觀察及生理生化試驗 將篩選出的抑菌活性最強的菌株在MRS固體培養基上進行劃線分離純化,37 ℃培養24 h,對單菌落進行革蘭氏染色[14],觀察其顯微鏡下個體形態,檢測各項生理生化指標[15-16],包括:接觸酶試驗、明膠水解試驗、葡萄糖產氣試驗和糖發酵試驗等。

1.2.3.2 16S rRNA序列分析 將篩選得到的菌株提取DNA基因組,通過PCR擴增技術獲取目的基因DNA片段,送往測序公司測序,PCR 反應條件:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,50 ℃復性30 s,72 ℃延伸1 min,35 次循環;最后72 ℃延伸10 min。從Gene Bank中選擇同源性親近的幾株菌株的16S rRNA基因序列,采用Clustalx 1.83軟件進行序列多重比較,用Mega 5.0軟件進行統計和聚類分析,構建系統發育樹,并對所構建的系統發育樹進行評估[17-18]。

1.2.4 抑菌動力學曲線 將篩選出的菌株以體積分數5%的接種量接種到MRS液體培養基中,37 ℃靜置培養72 h。每隔2 h在600 nm波長下測定光密度值,以未接種的發酵液作空白參照;每隔2 h測定接種發酵液pH，每隔4 h測定發酵上清液對大腸桿菌的抑菌活性。以時間為橫坐標,分別以吸光值、抑菌圈直徑和pH為縱坐標,得到菌株抑菌動力學曲線,確定最佳培養時間。

1.2.5 發酵液中抑菌物質的生物學特性 根據文獻[19-20]所述實驗方法,并有稍微改動,對發酵液中的抑菌物質進行生物學特性的探究。

1.2.5.1 效價測定 將100 mg Nisin標準品(效價為106IU/g)溶于100 mL無菌的0.02 mol/L鹽酸溶液中,配成103IU/mL的Nisin標準液。以0.02 mol/L鹽酸進行梯度稀釋,稀釋成效價分別為1、5、10、50、100、500 IU/mL。以Nisin效價對數值為橫坐標,抑菌圈直徑為縱坐標,作標準曲線。

1.2.5.2 pH耐受性 取10支試管裝等體積發酵上清液,用1 mol/L HCl或NaOH溶液將10支試管中的發酵上清液的pH分別調至2.0、3.0、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0,37 ℃水浴1 h后,每支試管分成兩份,一份將pH調回3.68,另一份不再調pH,比較將pH調回3.68和不調回的抑菌效果。

1.2.5.3 熱敏感性 取等體積發酵上清液分別置于40、60、80、100 ℃水浴處理1 h以及121 ℃高溫高壓處理20 min后,冷卻至室溫,以未處理的發酵上清液對照,測定抑菌效果。

1.2.5.4 表面活性劑的影響 將表面活性劑吐溫-80、吐溫-20、Triton X-100、SDS、EDTA和尿素分別加入到等體積發酵上清液中,使各物質的終質量濃度為1 mg/mL,37 ℃水浴處理2 h,以未經表面活性劑處理的發酵上清液為對照測定抑菌活性。

1.2.5.5 紫外線敏感性 取5份等體積發酵上清液平鋪于無菌平皿中,于20 W紫外燈下距離20 cm分別照射15、30、60、90、120 min,以未經紫外線照射為對照,測定抑菌活性。

1.2.5.6 抑菌譜測定 以金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、黑曲霉、米曲霉及釀酒酵母等16株菌為指示菌,按照雙層瓊脂擴散法,制作含不同指示菌的上層培養基,乳酸菌選用MRS培養基,霉菌選用PDA培養基,酵母菌選用YPD培養基,其它細菌選用LB培養基。檢測待測發酵上清液的抑菌活性,于各指示菌最適生長溫度條件下培養,測定其抑菌譜。

1.3 數據處理

實驗操作重復三次,每個樣品設3個平行,采用Origin 8.5和SPSS 20.0軟件進行數據分析及圖標繪制,測定結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 產抑菌物質乳酸菌的篩選

利用雙層瓊脂擴散法,對課題組自白酒窖泥中已分離的19株乳酸菌進行抑菌試驗,篩選結果如圖1,17號菌株抑菌圈直徑最小,為11.32 mm,16號菌株抑菌圈直徑最大,達到20.85 mm,故選取16號菌株作為進一步試驗的測試菌,并命名為LP16。

圖1 不同菌株的抑菌效果Fig.1 The antibacterial effect of different strains

2.2 乳酸菌所產抑菌物質的確定

2.2.1 酸及過氧化氫的排除 由圖2可看出,pH3.68的鹽酸、乙酸和乳酸對大腸桿菌無抑制作用。圖2中實驗組用過氧化氫酶處理發酵上清液后,殘余抑菌率為99.27%,仍有較強的抑菌效果。故可判斷有機酸和過氧化氫不是菌株LP16所產生的抑菌物質,存在其他抑菌物質。

圖2 酸及過氧化氫的排除Fig.2 The exclusion of acid and hydrogen peroxide注：1：未處理發酵上清液；2：鹽酸；3：乳酸； 4:乙酸；5:過氧化氫酶處理。

2.2.2 蛋白酶敏感性 圖3中發酵上清液經胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K和胰蛋白酶處理的結果顯示其抑菌活性均有不同程度的降低。胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶在37 ℃水浴2 h后,殘余抑菌率分別為40.43%、43.48%、47.83%和51.30%。說明乳酸菌產生的抑菌物質能被蛋白酶分解而使得抑菌活性大幅減弱,表明發酵上清液中有蛋白質類抑菌活性物質,即細菌素,這與王凈凈等[21]報道的細菌素相符。

圖3 菌株LP16的酶敏感性Fig.3 The enzyme sensitivity of strain LP16

2.3 產細菌素乳酸菌的鑒定

2.3.1 形態學觀察 菌株LP16在MRS固體平板上呈乳白色、邊緣光滑、圓形、微突起菌落。經革蘭氏染色后,在顯微鏡下呈藍紫色,為革蘭氏陽性,菌體形態呈桿狀,符合乳酸菌特征(圖4)。

圖4 菌落形態和鏡檢結果(100×10)Fig.4 The colony morphology and the micrograph (100×10)

2.3.2 生理生化試驗 如表1中接觸酶、明膠水解、淀粉水解、硫化氫試驗呈陰性,說明該代謝過程中不能分泌產生明膠酶和淀粉酶來降解大分子物質,也不能產生過氧化氫和硫化氫;葡萄糖產氣試驗呈陽性,以及對葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖等發酵均呈陽性,說明該乳酸菌能夠利用大部分糖。根據表1的結果,參照《伯杰細菌鑒定手冊》和《乳酸細菌-基礎、技術和應用》,可初步將菌株LP16鑒定為乳桿菌屬。

表1 菌株LP16生理生化鑒定結果Table 1 Physiological and biochemical identification of strain LP16

2.3.3 乳酸菌16S rRNA測序 將所測得的序列構建系統發育樹,結果如圖5,本次所篩選的LP16乳酸菌序列與GenBank中已公布的副干酪乳桿菌序列同源性高達99%。從比對結果結合革蘭氏染色等生理生化實驗可以確定本次實驗篩選的具有高效抑菌活性的菌株LP16為副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)。

圖5 基于16S rRNA的LP16菌株系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA sequence of strain LP16

2.4 抑菌動力學曲線

抑菌動力學曲線結果如圖6。菌株LP16培養4 h后進入對數期,24 h后進入穩定期。菌株LP16產酸能力強,初始pH為6.5,最終pH穩定在3.5左右。從4 h開始具有抑菌活性,進入穩定期后抑菌活性也基本穩定,在36 h達到最高水平。故選取發酵時間為36 h。

圖6 菌株LP16的抑菌動力學曲線Fig.6 The bacteriostasis kinetic curve of strain LP16

2.5 發酵液中抑菌物質的生物學特性

2.5.1 效價結果 以Nisin效價對數值為橫坐標,抑菌圈直徑為縱坐標,測得Nisin效價標準曲線回歸方程y=2.1242x+13.775(R2=0.9955),菌株LP16發酵上清液效價可達2137.96 IU/mL。

2.5.2 pH耐受性 由圖7結果可知,將pH調至2～10,37 ℃水浴保溫1 h后pH不調回初始值直接作抑菌試驗,分析出菌株LP16上清液在pH4.5時殘余抑菌率只保留了62.5%,在pH5.0時喪失活性。然而保溫1 h后將pH調回初始值,菌液再次出現抑菌活性,在pH2～10范圍內殘余抑菌率均在80%以上,保持穩定的抑菌活性。說明菌株LP16具有酸堿耐受性,但發揮抑菌作用需在酸性(pH<5)環境中。大部分細菌素在酸性條件下穩定,在中性或堿性條件下即會失活[22],但菌株LP16產生的細菌素具有寬泛的酸堿耐受性。

圖7 不同pH時菌株LP16細菌素的抑菌效果Fig.7 The antibacterial effect of different pH on strain LP16 of bacteriocin

2.5.3 熱敏感性 如圖8可知,菌株LP16所產細菌素經40、60、80、100 ℃水浴1 h,甚至在121 ℃高溫高壓下處理20 min,都能保持90%以上的活性殘余抑菌率,具有很好的熱穩定性,該特性類似于大多數細菌素[20]。

圖8 菌株LP16細菌素的熱敏感性Fig.8 The heat sensitivity of bacteriocin produced by strain LP16

2.5.4 表面活性劑敏感性 表面活性劑常應用于食品工業中用于改善食品的品質,通常具有濕潤、分散、乳化、起泡、保濕等作用[23]。菌株LP16所產抑菌物質對表面活性劑的敏感性結果如圖9,尿素、吐溫-20對菌株LP16發酵上清液的抑菌活性幾乎沒有影響,殘余活性保持在90%左右,吐溫-80、SDS、EDTA對細菌素的抑菌活性有促進作用,而Triton X-100對細菌素的抑菌活性有抑制作用,殘余抑菌率為70.25%。

圖9 不同化學試劑對菌株LP16細菌素的抑菌效果Fig.9 The antibacterial effect of different chemical reagent on strain bacteriocin of LP16

2.5.5 紫外線敏感性 表2中紫外線處理后的細菌素,在1 h內隨著紫外線照射時間的延長,上清液抑菌效果呈緩慢降低趨勢,與冉軍艦等[24]報道的紫外線影響變化趨勢前期相似,但其在1 h后活性就顯著降低了,而菌株LP16的抑菌活性仍保持在80%以上,說明紫外照射不能使該細菌素發生變性,該細菌素對紫外線不敏感。

表2 紫外線敏感性Table 2 Sensitivity to ultraviolet light

2.5.6 抑菌譜測定 以革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌,革蘭氏陰性菌大腸桿菌、霉菌、酵母菌、乳酸菌等16株菌為指示菌,檢測菌株LP16上清液的抑菌譜。從表3可知其對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌,以及革蘭氏陰性菌大腸桿菌有較強的抑菌效果,也對部分乳酸菌有抑菌效果,但對霉菌和酵母菌等真菌沒有抑菌效果。因此該細菌素存在于白酒窖泥中,不僅能抑制有害菌的生長,也不影響霉菌和酵母菌產酒的作用,同時能抑制部分乳酸菌生長,以減少乳酸的過多生成。

表3 菌株LP16上清液的抑菌譜Table 3 Antimicrobial spectrum of the fermentation supernatant of strain LP16

3 結論

乳酸菌在發酵過程中能夠產生乳酸、乙酸、H2O2、細菌素等天然活性抑菌物質,因此通過排除酸、過氧化氫的干擾和蛋白酶處理試驗,確定了菌株LP16產生的抑菌物質具有蛋白質屬性,是一種細菌素。同時,通過形態學觀察、生理生化鑒定和16S rRNA序列分析,確定該產細菌素菌株LP16為副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)。

細菌素生物學特性研究顯示,菌株LP16所產細菌素具有良好的熱穩定性,在121 ℃高溫高壓處理20 min仍有較高抑菌活性;同時也具有寬泛的酸堿耐受性,但是必須在酸性環境中才有抑菌效果。抑菌譜測定顯示菌株LP16對部分革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌有抑菌效果,也對部分乳酸菌有抑菌效果,但對霉菌和酵母菌等真菌沒有抑菌效果。濃香型白酒發酵過程中窖池溫度控制在25～35 ℃以及低pH下,而霉菌和酵母菌是發酵不同時期的優勢菌株,有利于產酒[3,25-26],因此,副干酪乳桿菌LP16產生的細菌素能在窖池中發揮一定抑菌作用抑制有害菌的生長,而不影響霉菌和酵母菌發揮產酒作用。濃香型白酒中乳酸乙酯的過多生成會影響酒的口感,菌株LP16產生的細菌素能抑制部分乳酸菌的生長,使乳酸的生成減少,為控制乳酸乙酯的產生提供理論思路。