獼猴桃廣譜拮抗內生菌分離鑒定 及其對櫻桃圣女果采后的保鮮作用

, , ,, ,*,,*

(1.湖南農業大學食品科學技術學院,湖南長沙 410128; 2.湖南農業大學園藝園林學院,湖南長沙 410128)

植物內生菌是存在于健康植物各種組織器官或植物間隙內的真菌、細菌和放線菌。研究表明內生菌與宿主之間建立了緊密的生態關系,由于它產生的次生代謝物質對植物和生態環境無害、不易產生抗藥性、低劑量抑制病原物等優點,因此越來越受到人們的關注[1]。國內外已經利用一些藥用、海洋植物等進行內生菌的分離、鑒定研究,它們次級代謝物在抗癌抗蟲、保鮮防腐等方面都有應用研究,然而對于果蔬內生菌的分離和鑒定的研究及其應用研究仍然具有很大的空間[2-3]。

圣女果屬于呼吸高峰型果實,水分含量達70%以上,含有多種營養物質,其商品食用及藥用價值極大。研究發現,圣女果采后微生物病原菌主要為鏈格孢、灰葡萄孢、根霉屬菌等,但事實上的還有炭疽病菌、疫霉屬和殼針孢屬等。圣女果保鮮技術使得長期使用化學保鮮劑對生態環境造成了破壞,致病菌產生抗藥性。低溫貯藏成本較高且易使圣女果發生冷害[4]。利用植物內生菌防治作物病害是一個潛力巨大的新型領域,微生物拮抗技術融入傳統的保鮮技術中,能降低我國果蔬的采后損失率,以獲得高品質、價格適中、安全性強的果蔬[5]。

本研究從獼猴桃分離的一株對八株果蔬采后致病菌有明顯拮抗作用的內生菌為材料,擬通過對其生理生化鑒定、抑菌特性、抑菌譜測定及研究其發酵濾液對回接致病菌圣女果的保鮮效果。旨在明確此菌株在果蔬保鮮中的實用價值,為后續內生菌次級代謝物在果蔬保鮮應用提供參考和依據[6-7]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

獼猴桃(翠玉)的根、莖、葉和果實 湖南省農業科學院果園；櫻桃圣女果(萬紫紅) 湖南省農業科學院果園；辣椒炭疽病菌(C.gloeosporioides)、辣椒白絹病菌(Sclerotiumrolfsii)、葡萄座腔病菌(Botryosphaeriadothidea)、白菜黑斑病菌(Alternariabrassicae)、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、辣椒疫病菌(Phytophthoracapsici) 湖南農業大學14教314實驗室；鏈格孢(Alternarianees) 廣東省食品微生物安全工程技術研發中心；灰葡萄孢(Botrytiscinerea) 中國農業微生物菌種保藏中心； LB固體培養基、高氏一號固體培養基+50 mg·L-1重鉻酸鉀、PDA培養基、馬鈴薯瓊脂培養基(pH自然)、內生菌發酵液、LB液體培養基(pH7.0～7.2)、淀粉培養基、糖發酵培養基、油脂培養基、明膠液化培養基 國藥集團化學試劑有限公司；復合果蔬保鮮劑(脫氫乙酸鈉、乳酸鏈球菌素、丙酸鈣、防腐酶制劑等) 博涵誠信食化；革蘭氏染色液 長沙裕豐化器械有限公司；Ex Taq酶、dNTP TaKaRa；引物 Invitrogen；無水乙醇、次氯酸鈉、N,N-二甲基對苯二胺鹽酸鹽 國藥集團化學試劑有限公司。

LRH-250型號生化培養箱 上海飛躍實驗儀器有限公司;HR/T16M冷凍離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司;RDN-260D-3人工氣候箱 寧波樂電儀器制造有限公司;SW-CJ-1FD型號超凈工作臺 蘇潔凈化設備制造責任有限公司;DYY-6C型號電泳儀 北京六一儀器制造廠;Gel Logic212型號凝膠成像系統 美國柯達公司;BCD-197K冰箱 河南新飛電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 內生菌的分離 選健康、表面無破損的獼猴桃根、莖、葉和果實。取根、莖、葉各5 g和整個果實,先用清水洗凈,再用75%乙醇清洗表面后,用5% NaClO溶液浸泡5 min,無菌水沖洗3次,無菌濾紙吸干水分。用無菌小刀取根、莖、葉和果實各1 g,加9 mL無菌水于無菌研缽中碾碎成勻漿,10倍梯度稀釋得到10-2、10-3的稀釋液。移取勻漿100 μL于PDA、高氏一號、LB培養基中,均勻地涂布于培養基表面,28 ℃黑暗培養48～72 h。最后一次清洗的無菌水取0.1 mL涂平板,作為對照組,當無菌長出,表明樣品表面無菌,實驗重復3次[8-9]。

選擇菌落總數在10～100 CFU/g,參考國家標準菌落總數計數方法,根據菌落顏色、形態、光澤、邊緣整齊度、菌落濕潤情況描述菌落特征并統計菌落數量和種類,純化后試管斜面上4 ℃保存。

1.2.2 拮抗菌篩選 以18株獼猴桃內生菌為拮抗菌,辣椒白絹病菌、油菜菌核病菌、葡萄座腔菌3種采后致病菌為指示菌,平板對峙法[10]篩選出對指示菌有拮抗效果的內生菌。用直徑5 mm的打孔器打孔菌餅,生長致病菌的一面置于馬鈴薯瓊脂培養基表面中心位置,28 ℃培養。待菌餅直徑長到20 mm,距離菌絲邊緣20 mm處劃線接種內生菌,待菌絲剛長滿平板,測量內生菌對致病菌的拮抗直徑。

1.2.3 菌株菌落形態觀察 參考文獻[7]方法,于LB固體培養基劃線,28 ℃生化培養箱培養48 h,觀察菌落特征。挑選單個菌落,經革蘭氏染色后,于100×顯微鏡下觀察單個菌體形態特征。

1.2.4 菌株生理生化的分析鑒定 參照常見菌種鑒定手冊[11-12]對篩選出的拮抗菌進行生理生化鑒定。

1.2.5 16S rRNA序列分析 DNA的提取:分離菌株內生菌連續兩代活化后,接種到液體培養基中,以30 ℃,180 r/min的條件搖床培養48 h,采用CTAB法提取菌株總DNA。

PCR擴增:用于16S rRNA擴增的引物為細菌通用引物,正向引物為:5′-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3′;反向引物為:5′-ACGGCTACCTTGTT ACGACT-3[13]。PCR 反應體系(20 μL):正向引物0.8 μL;反向引物0.8 μL;模板0.5 μL;水14.1 μL。PCR反應條件為:95 ℃預變性5 min,95 ℃變性30 s,55 ℃退30 s,72 ℃延伸40 s,循環35次,72 ℃延伸10 min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳25 min,將得到的純PCR擴增產物送到長沙基源生物公司測序。所得序列通過NCBI數據庫進行Blast比對,將得到的序列用MEGA[14]軟件進行分析并構建系統發育樹。

1.2.6 發酵濾液的制備 內生菌MR-1在PDA培養基上連續培養兩代后,挑選單個菌落的1環于10 mL的無菌水中,用旋渦旋轉器振蕩均勻,取2 mL菌懸液于LB液體培養基中,180 r/min、28 ℃搖床振蕩培養48 h。于10000 r/min、4 ℃離心15 min,得離心液。再用0.22 μm無菌過濾器過濾,濾液待用。

1.2.7 抑菌活性的測定 量取25 mL的PDA培養基于50 mL錐形瓶中,經過121 ℃高壓滅菌后,倒平板,于平板中心位置倒置直徑為5 mm的菌餅。距中心25 mm的位置用直徑為12 mm的打孔器打孔,并剔除其中的培養基,取200 μL的發酵濾液于孔中,無菌水作為對照組。待液體完全滲透到培養基中,置于28 ℃恒溫培養箱中培養。致病菌菌絲剛好長到空白組孔徑邊緣附近,測量兩個圓心之間菌絲的生長直徑,分別記作Rck、R實驗[15-16]。

式中:R實驗為實驗組菌塊直徑,RCK為對照組菌塊直徑。

1.2.8 病原菌致病性研究 PDA培養基上連續培養兩代的8株果蔬致病菌,分別是辣椒炭疽病菌、辣椒白絹病菌、葡萄座腔病菌、白菜黑斑病菌、油菜菌核病菌、辣椒疫病菌(Phytophthoracapsici)、鏈格孢、灰葡萄孢。用無菌打孔器取直徑5 mm的菌餅,部分培養基可較好地粘著在果實表面。用無菌棉吸附75%的乙醇擦拭果實表面,再用無菌水洗凈晾干備用。通過接種的病斑感染圣女果的程度,可判斷被接種致病菌致病能力的大小,病原菌接種果實分為有傷和無傷兩種接種方式。有傷接種是在果實表面用一次性針頭刺破5個孔,孔眼集中在直徑5 mm圓中,用打孔器打取在直徑約5 mm菌餅,剛好覆蓋打孔處,于25 ℃、85%濕度條件下培養3～7 d。陽性對照為無傷接種,即接種菌餅于無傷果實表面,陰性對照組接種無菌培養基,實驗重復3次。接種后需用75%的乙醇擦拭的保鮮袋隔離以達到保濕、防污染的作用[17]。

1.2.9 拮抗菌生物防治對櫻桃圣女果有傷感染致病菌的影響研究 挑選硬度大、飽滿圓潤、外觀整齊、無損傷的健康圣女果果實,用無菌棉吸附75%的乙醇擦拭果實表面,再用無菌水洗凈晾干,果實表面用一次性針頭刺破5個孔,孔眼集中在直徑5 mm圓中,立即于傷口處噴灑MR-1發酵濾液,靜置2 h后,分別接種鏈格孢、灰葡萄孢菌、辣椒炭疽病菌致病菌餅,以復合果蔬保鮮劑做陽性對照,無菌水作為空白對照,將處理后的櫻桃圣女果于25 ℃、85%濕度的人工氣調箱貯藏8 d,每隔2 d記錄一次腐爛直徑。每組隨機挑選10個果實,實驗重復3次[18]。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 獼猴桃根、莖、葉及果實中內生菌的分布

從獼猴桃根、莖、葉及果實中一共分離出了18株內生菌,見表1。包括2株內生真菌,3株內生放線菌,13株內生細菌。分別從根中分離了10株內生菌,從莖中分離出3株內生菌,從葉片中分離出3株內生菌,從果實中分離出2株內生菌。

表1 獼猴桃根、莖、葉及果實中內生菌的分布和數量Table 1 Distribution and number of endophytes in kiwifruit roots,stems,leaves,and fruits

2.2 具有廣譜抑菌效果的內生菌的篩選

以辣椒白絹菌、葡萄座腔菌、油菜菌核菌病菌為指示菌,以18種內生菌為拮抗菌,通過平板對峙法,發現MR-1、根2、葉1、根11均表現比較明顯的廣譜性抑制效果(表2),其中MR-1對3種采后致病菌均具有較強的拮抗抑菌效果。

表2 內生菌對采后致病菌拮抗作用的測定Table 2 Inhibition effect of entophyteon postharvest pathogens

2.3 菌株MR-1的菌落形態特征

由圖1、圖2可知，內生菌MR-1單個菌落是乳白色不透明,褶皺,菌體易挑取,菌落直徑約0.2～0.5 mm。在100×顯微鏡下,菌體呈桿狀,革蘭氏染色呈陽性。

圖2 內生細菌MR-1革蘭氏染色(100×)Fig.2 Gram staining of endophytic bacteria strain MR-1(100×)

圖1 內生細菌MR-1菌落形態Fig.1 Colony morphology of endophytic bacteria strain MR-1

2.4 菌株MR-1的生理生化反應特性

細菌MR-1的生理生化反應結果表明(表3),MR-1好氧,低溫不能夠生長,能分解淀粉和油脂,硝酸鹽還原實驗陽性,明膠液化陽性,葡萄糖產氣陽性,過氧化氫反應陽性,接觸酶反應陽性,氧化酶反應陰性,V-P反應陽性,甲基紅反應陰性,硫化氫反應陰性,葡萄糖產酸陰性,初步確定為一種解淀粉芽孢桿菌。

表3 內生細菌MR-1的生理生化特性Table 3 Biochemical and physiological of endophytic bacteria strain strain MR-1

2.5 菌株MR-1的16S rRNA序列分析

將菌株MR-1的DNA提取后進行PCR擴增得到單一條帶(圖3),經過回收純化后測序,序列長度為1423bp。將測得的菌株序列上傳至NCBI基因序列分析網站進行同源性分析,并選取與其相近序列的菌株,發現提交序列與100種菌株的16S rRNA的序列極為相似,同源性達到99%,其中登陸號為KF933607.1的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)菌株BDH11的16S rRNA的序列與拮抗菌MR-1(全長1423bp)大小基本相同,同源性達到100%,通過MEGA軟件構建系統發育樹(圖4),兩株菌株在發育樹處于同一分支。綜合生理生化鑒定,可以確定MR-1為一株解淀粉芽孢桿菌。

圖4 內生細菌MR-1及近源菌16S rDNA序列系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of entophytic bacterium strain MR-1 and its relatives based on 16S rRNA

圖3 內生細菌MR-1 16S rRNA PCR擴增產物電泳圖Fig.3 Electrophoresis of PCR amplified products from 16S rRNA of endophytic bacteria strain MR-1注:M:DL2000 DNA Marker。

2.6 打孔法測MR-1發酵濾液對采后致病真菌的抑制率

實驗結果表明(表4),內生解淀粉芽孢桿菌MR-1對8種常見的植物病原菌均有較強的拮抗作用,其中對灰葡萄孢的抑制作用最強,抑制率達到了48.00%。對葡萄座腔菌的抑制效果最差,僅為16.00%。灰葡萄孢、鏈格孢和炭疽病菌是櫻桃圣女果主要的病害菌,MR-1發酵液對這3種致病菌表現較強的抑制作用。

表4 MR-1發酵濾液對8種植物采后病原菌的抑制率Table 4 Inhibition effect of the crude fermentation on eight phytopathogenic fungi

2.7 致病菌對櫻桃圣女果的致病性研究

如圖5～圖12，實驗第4 d,受到葡萄座腔病菌感染的圣女果果實腐爛體積超過1/2,受到辣椒炭疽感染后的果實呈濕潤狀,病斑為褐色,果實凹陷,受到灰葡萄孢感染的果實表現果皮成為灰白色水漬狀,變軟腐爛,受到鏈格孢感染的果實凹陷軟爛。實驗表明,圣女果容易受到辣椒炭疽病菌、葡萄座腔病菌、灰葡萄孢的侵染,比較容易受到鏈孢格的感染,能受到辣椒白絹菌和白菜黑斑菌的感染,但是辣椒疫病和油菜菌核比較難感染圣女果傷口。

圖5 感染辣椒炭疽病的圣女果Fig.5 Infected cherry tomatoes with C. gloeosporioides

圖6 感染鏈格孢的圣女果Fig.6 Infected cherry tomatoes with Alternaria nees

圖7 感染灰葡萄孢的圣女果Fig.7 Infected cherry tomatoes with Botrytis cinerea

圖8 感染葡萄座腔菌的圣女果Fig.8 Infected cherry tomatoes with Botryosphaeria dothidea

圖9 感染白菜菌核菌的圣女果Fig.9 Infected cherry tomatoes with Alternaria brassicae

圖10 感染辣椒白絹菌的圣女果Fig.10 Infected cherry tomatoes with Sclerotium rolfsii

圖11 感染辣椒疫病菌的圣女果Fig.11 Infected cherry tomatoes with Phytophthora capsici

圖12 感染油菜菌核菌的圣女果Fig.12 Infected cherry tomatoes with Sclerotinia sclerotiorum

2.8 拮抗菌生物防治對櫻桃圣女果有傷感染致病真菌的影響

2.8.1 拮抗菌生物防治對櫻桃圣女果有傷感染鏈格孢的影響 隨著貯藏期的延長,鏈格孢侵染圣女果的直徑不斷增大(圖13)。不同貯藏期各處理之間呈極顯著差異(p<0.01)。在整個貯藏期間,經發酵濾液處理的圣女果保鮮效果最好,其次為復合果蔬保鮮劑,其腐爛直徑均低于無菌水處理。貯藏第8 d,圣女果經發酵液處理和保鮮液處理的腐爛直徑分別為7.8和8.5 mm,與空白對照組相比,降低了50.6%和46.2%,呈顯著性差異(p<0.05)。

圖13 不同試劑處理對回接鏈孢格的圣女果的影響 Fig.13 Effect of different reagent treatments on cherry tomatoes with Alternaria nees

2.8.2 拮抗菌生物防治對櫻桃圣女果有傷感染灰葡萄孢的影響研究 隨著貯藏期的延長,灰葡萄孢侵染圣女果的直徑不斷增大(圖14)。不同貯藏期各處理之間呈極顯著差異(p<0.01),在整個貯藏期間,經發酵濾液處理的圣女果保鮮效果最好,其次為復合果蔬保鮮劑,其腐爛直徑均低于無菌水處理。貯藏第8 d,圣女果經發酵液處理和復合果蔬保鮮劑處理的腐爛直徑為9.2和8.0 mm,與空白對照組相比,分別降低50.6%和43.2%,呈顯著性差異(p<0.05)。

圖14 不同試劑處理對回接灰葡萄孢的圣女果的影響Fig.14 Effect of different reagent treatments on cherry tomatoes with with Botrytis cinerea

2.8.3 拮抗菌生物防治對櫻桃圣女果有傷感染辣椒炭疽病菌的影響研究 隨著貯藏期的延長,辣椒炭疽病菌侵染圣女果的直徑不斷增大(圖15)。不同貯藏期各處理之間呈極顯著差異(p<0.01),在整個貯藏期間,經發酵濾液處理的圣女果保鮮效果最好,其次為復合果蔬保鮮劑,其腐爛直徑均低于無菌水處理。貯藏第8 d,圣女果經發酵液處理和復合果蔬保鮮劑處理的腐爛直徑為10.8和9.8 mm,與空白對照組相比,分別降低了44.9%和39.3%,呈顯著性差異(p<0.05)。

圖15 不同試劑處理對回接辣椒 炭疽病菌的圣女果的影響Fig.15 Effect of different reagent treatments on cherry tomatoes with C.gloeosporioides

3 討論

獼猴桃內生菌種類和數量較多,郭睿文[19]從獼猴桃的芽孢、葉片和莖部分離出來了大量的內生菌,陳超[7]從果肉中分離了一株對獼猴桃座腔菌的抑制率達到64.72%的內生細菌。本文首次從獼猴桃根、莖、葉和果實中分離內生菌,測定強活性菌株MR-1對8種采后致病菌的抑制率,發現其對圣女果常見致病菌有較強的抑制生長的作用。在圣女果保鮮實驗中,針對圣女果的主要采后致病菌灰葡萄孢、鏈格孢以及辣椒炭疽病菌,內生菌MR-1的發酵濾液均具有較強的抑菌效果,然而其保鮮機制和最適宜處理濃度待進一步研究。

復合果蔬保鮮劑包含脫氫乙酸鈉、乳酸鏈球菌素、丙酸鈣、防腐酶制劑等,主要是化學試劑,長期使用會使病原菌產生抗藥性,環境中也會導致藥物殘留,破壞生態。解淀粉芽孢桿菌作為芽孢桿菌屬的一種,分泌的抑菌物質有很多種,常見的種類分為脂肽類物質、聚酮類物質還有具有蛋白活性的抑菌物質。解淀粉芽孢桿菌的抑菌作用研究已經廣泛開展,并且利用解淀粉芽孢桿菌進行生物防治的前景十分廣闊,但是生物體是復雜多變的,仍然有很多東西是未知的[20-23]。

實驗表明內生細菌MR-1具有廣譜抑菌作用,對多種果蔬致病菌具有很強的抑制效果,其發酵濾液為它的次級代謝產物,其所含活性物質的種類和抑菌機理需要進一步深入研究。

4 結論

本研究從獼猴桃根、莖、葉和果實中分離出來了18株內生菌,其中內生菌MR-1對鏈格孢、灰葡萄孢、辣椒炭疽病菌、辣椒疫病病菌、辣椒白絹病菌、油菜菌核菌、白菜黑斑病菌、葡萄座腔菌8種致病菌均有較強的抑制效果。通過菌體、菌落形態觀察、生理生化測定及16S rRNA序列分析,鑒定其為一株解淀粉芽孢桿菌。此外,鏈格孢、灰葡萄孢、辣椒炭疽病菌能夠通過有傷接種的形式感染圣女果,導致果實腐爛變質。以鏈格孢、灰葡萄孢、辣椒炭疽病菌有傷感染圣女果,相比無菌水對照組,腐爛直徑分別下降了50.6%、50.6%、44.9%,整個儲藏期間,內生菌MR-1發酵液能較好的控制圣女果的腐爛變質。