兩種黃酮類銅(II)配合物的 制備及體外抗氧化活性

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(華南農業大學材料與能源學院,廣東廣州 510642)

天然黃酮化合物是自然界中一類重要的微量營養物。這類化合物以黃酮母核為結構基礎,通過在環(A,B和C環)上不同位置發生羥基等活性基團取代而形成一系列結構相似的衍生物[1]。黃酮化合物因具有清除體內自由基、抗癌、抗病毒、抗菌、消炎等活性而具有重要的藥用價值,尤其是作為天然抗氧化劑，可將活潑、有害的自由基還原成穩定、無害的物質[2-3]。

金雀異黃酮和山奈酚作為常見的黃酮類化合物,因具備豐富的生物活性而被廣泛使用,但在實際的工業生產中仍然存在許多不足,比如作用位點較多、選擇性和穩定性不強、溶解度和生物利用度低等,這些缺點嚴重限制了此類黃酮化合物的高效利用。人們為了提高黃酮化合物的生物活性,改善其溶解性和生物利用度,通常采用酯化、甲基化或引用親水基團等進行結構修飾[4],或者是利用黃酮化合物中含有孤對電子的羥基氧和羰基氧與金屬離子配位形成金屬配合物[5],從而增強配體的生物活性或產生新功能[6]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金雀異黃酮 分析純，阿拉丁試劑有限公司；山奈酚 分析純，上海邁瑞爾化學技術有限公司；無水乙醇、雙氧水、乙二胺四乙酸 分析純，廣州化學試劑廠；二甲基亞砜(DMSO) 分析純，天津市博迪化工有限公司；氯化銅、水楊酸、四甲基乙二胺、高氯酸、六次甲基四胺 分析純，國藥集團化學試劑有限公司；氫氧化鈉 分析純，天津市大茂化學試劑廠；硫酸亞鐵 分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；抗壞血酸、氯化硝基四氮唑藍(NBT) 生物試劑，國藥集團化學試劑有限公司；核黃素 生物試劑，上海伯奧生物科技有限公司。

78HW-1磁力攪拌器 金壇市江南儀器廠;FE20實驗室pH計 Mettler Toledo有限公司;ACATAR 360 FT-IR型紅外光譜儀(KBr壓片) 美國Nnicolet公司;Pharmacia UV-2550紫外-可見分光光度計 日本Shimadzu公司;Vario EL元素分析儀 德國Elementar公司;STA 409 PC/PG 熱分析儀 德國Netzsch公司;721型分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;HK-1D超級恒溫水槽 南京大學物理研究所;SYC-15B超級恒溫水浴 南京桑力電子設備廠;SXL-1008程控式電爐 上海精宏實驗設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 兩種配合物的合成 參考文獻方法[7],分別稱取0.0676 g金雀異黃酮和0.0716 g山奈酚并置于2個150 mL圓底燒瓶中,各加入10 mL無水乙醇,用磁力攪拌器40 ℃下加熱攪拌,使固體完全溶解,然后分別加入等物質的量的氫氧化鈉,繼續攪拌30 min;再向溶液中滴加0.5 mL 0.5 mol/L的氯化銅溶液,并加入去離子水至溶液總體積為20 mL,60 ℃下攪拌4 h。溶液靜置12 h,分別有黃綠色和深褐色沉淀生成,過濾,固體產物分別經水和無水乙醇洗滌數次,將其置于真空干燥器中室溫干燥2 d,樣品管密封保存備用。

1.2.2 配合物中的元素含量分析 配合物1和2中的C、H元素含量采用德國元素分析儀測定。銅離子含量利用EDTA絡合滴定法測定[8]:稱取0.2 g配合物于坩堝中,900 ℃下灼燒至完全分解,用HClO4溶解灼燒殘留物并定容至100 mL,加入六次甲基四胺調節溶液的pH至5～5.5,以二甲酚橙為指示劑,用0.0100 mol/L EDTA標準溶液滴定,實驗平行三次。銅離子含量的計算公式為:

式(1)

式中:CEDTA為EDTA標準溶液的物質的量濃度,mol/L;VEDTA為滴定過程中所用的EDTA標準溶液體積,mL;MCu=63.55,為銅的相對原子質量。

1.2.3 配體及配合物的紅外光譜測定 采用KBr壓片法,在400～4000 cm-1范圍內,運用紅外光譜儀測定了配體金雀異黃酮、山奈酚和配合物1和2的紅外光譜。

1.2.4 配體及配合物的電子吸收光譜測定 在200～600 nm內,運用紫外可見分光光度計分別測定了金雀異黃酮、山奈酚以及配合物1和2的電子吸收光譜。

1.2.5 配合物的熱重分析 采用熱分析儀,在氬氣保護下，分別測定了配合物1和2的熱分解,溫度工作范圍為25～750 ℃,升溫速率為10 ℃/min。

1.2.6 配合物的抗氧化活性測定

空白反應液的配制:稱取0.0381 g NBT溶于10 mL PBS緩沖溶液(5.800 g十二水合磷酸氫二鈉和0.593 g二水合磷酸二氫鈉溶解于水中,定容至100 mL,pH為7.4)中,得到溶液a;準確稱取0.0032 g核黃素(VB2)溶于100 mL PBS緩沖溶液中,得到溶液b;取1 mL四甲基乙二胺用PBS緩沖溶液定容至100 mL,得到溶液c。取20 mL溶液b和382 μL溶液c于500 mL容量瓶中,加入5 mL溶液a混合定容,得空白反應液,避光保存。

1.2.6.2 水楊酸法測定配合物清除·OH活性 參考文獻[10],根據經典的Fenton反應體系,準確配制9.0 mmol/L硫酸亞鐵溶液,9.0 mmol/L水楊酸-乙醇溶液,8.8 mmol/L過氧化氫儲備溶液。分別移取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和1 mL的銅(II)配合物溶液于(溶液濃度為1.0×10-3mol/L)比色管中,然后依次加入0.5 mL硫酸亞鐵溶液,0.5 mL水楊酸-乙醇溶液,0.5 mL雙氧水溶液,1 mL DMSO,總體積用去離子水定容至5.0 mL,配合物的最終濃度梯度為2×10-5、4×10-5、6×10-5、8×10-5、1×10-4和2×10-4mol/L。充分混勻后于37 ℃水浴中恒溫30 min。在510 nm處測定反應體系的吸光度值,測定重復三次。清除率計算公式為:

式(2)

式中:A0為空白對照溶液的吸光度,Ax為加樣品后溶液的吸光度,Ax0為不加 H2O2的溶液的吸光度。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 配合物的元素分析結果

配合物1和2的元素分析結果見表1。根據實驗結果,推測出金雀異黃酮和山奈酚與氯化銅均以2∶1的摩爾比形成目標配合物。配合物1可能的分子式為C30H28O15Cu,C、H含量測定結果分別為C：52.23%(52.06%,理論值),H:3.84%(4.08%,理論值),銅離子含量為9.42%(9.19%,理論值);配合物2可能的分子式為C30H25O15.5Cu,C、H含量測定結果分別為C:51.81%(51.69%,理論值),H:3.92%(3.62%,理論值),銅離子含量為9.33%(9.12%,理論值)。

表1 配合物1和2的組成及元素分析Table 1 Elemental analysis of complexes 1 and 2

2.2 配合物的紅外光譜分析

配體及配合物1和2的紅外光譜如圖1所示,主要紅外數據列于表2。配體和配合物在3300～3500 cm-1均出現了一個寬峰,歸屬為黃酮母核上羥基的伸縮振動。在1600～1700 cm-1,配合物1和2均出現了羰基伸縮振動峰,相對于對應的配體,配合物中的羰基伸縮振動峰向低波數移動,原因是羰基上的氧原子與銅(II)配位后,使得羰基成鍵電子密度更加偏向氧原子,造成C=O鍵電子云密度下降,從而降低了羰基的雙鍵性[11],這說明黃酮母核C環上的4位羰基氧與銅(II)配位。配體黃酮母核C環上的C=C的伸縮振動峰在1500～1650 cm-1,而在配合物中C=C伸縮振動峰向低波數移動了10～20 cm-1,歸因于銅(II)與羰基配位后擴大了C環的π鍵離域范圍。在1200～1300 cm-1,羥基峰的強度明顯減弱,并且伴有藍移,再次證明配合物中羥基數目減少,有部分羥基參與了配位。另外,在613、630 cm-1處出現了Cu-O鍵的伸縮振動吸收[12]。

表2 配體及配合物1和2的主要紅外數據(cm-1)Table 2 IR spectra(cm-1)of the ligands and complexes 1 and 2

圖1 配體及配合物的紅外圖譜Fig.1 IR spectra of the ligands and complexes

2.3 配合物的電子吸收光譜分析

配體及配合物的電子吸收光譜如圖2所示。在配體和配合物1和2的電子吸收光譜中,均有兩個主要的特征譜帶Band Ⅰ和Band Ⅱ,其中,Band Ⅰ歸屬為黃酮母核B環上的π→π*電子躍遷,Band Ⅱ歸屬為A環上的π→π*電子躍遷[13]。通過與配體的譜帶進行對比,目標配合物的兩條譜帶均發生了不同程度的紅移。在金雀異黃酮和配合物1中,Band Ⅰ由332 nm紅移至389 nm,Band Ⅱ由262 nm紅移至266 nm;在山奈酚和配合物2中,Band Ⅰ由367 nm紅移至417 nm,Band Ⅱ由267 nm紅移至280 nm。這些譜帶的紅移主要是因為形成的新螯合環使得整個分子的離域體系重新進行電子分布,形成能量更低,范圍更廣的π電子離域系統[14]。

圖2 配體及配合物的電子吸收光譜Fig.2 Electronic absorption spectra of the ligands and complexes

2.4 配合物的熱重分析

配合物的熱重分析如圖3所示。結果表明,在配合物1中,從室溫到315 ℃共有2個明顯的失重過程,分別對應于結晶水和配位水的失重,其中第一個失重過程的失重率為8.45%,推測配合物1含有3個結晶水(理論值為7.81%);第二個失重過程的失重率為5.35%,推測含有2個配位水(理論值為5.65%);315 ℃以后,配體金雀異黃酮開始逐步分解,最終殘留物為氧化銅和部分碳的混合固體。配合物2與配合物1發生了類似的熱分解過程。在配合物2中,從室溫到327 ℃同樣有2個明顯的失重過程,分別對應于結晶水和配位水的失重,其中結晶水的失重率為3.65%,推測含有1.5個結晶水(理論值為3.88%);配位水的失重率為5.15%,推測含有2個配位水(理論值為5.38%);327 ℃以后,配體山奈酚開始逐步分解,最終殘留物為氧化銅和部分碳的混合固體。

圖3 配合物的熱重分析Fig.3 Thermogravimetric analysis of the complexes

綜合上述配合物的元素分析、紅外光譜、電子吸收光譜和熱重分析測定結果,結合參考文獻[15-16],可推測配合物1和2的分子式分別為[Cu(Gen)2(H2O)2]·3H2O(1)和[Cu(Kae)2(H2O)2]·1.5H2O(2),可能的分子結構如圖4所示。

圖4 配合物可能的分子結構Fig.4 The possible molecular structure of the complexes

2.5 配合物的抗氧化活性分析

圖5 配合物對的清除率Fig.5 The scavenging ratios of the complexes to superoxide anion radicals

2.5.2 水楊酸法測定配合物清除·OH活性 ·OH是最活躍、進攻性最強的活性氧(ROS)自由基之一,具有存在時間短、攻擊性強、破壞性大等特點,生物體內多余的·OH會對機體健康產生非常嚴重的影響。

根據經典的水楊酸法,測定了Fenton反應中配合物清除·OH的能力,實驗結果如圖6所示。從圖中可以看出,金雀異黃酮、山奈酚和配合物1和2清除·OH的能力均隨著濃度的增大而增強,并且在相同濃度下,山奈酚比金雀異黃酮清除·OH的能力強,主要是因為山奈酚擁有更多的取代羥基,能提供更多的羥基質子。

圖6 黃酮配體和配合物對·OH清除率的影響Fig.6 The scavenging rates of the ligands and complexes to hydroxyl radicals

相對于黃酮配體,配合物清除·OH的能力都進一步增強,表明黃酮化合物與銅(II)之間存在的正協同作用。推測主要有以下原因:首先,當銅(II)與配體的C4位羰基氧和C3或者C5位羥基氧雙齒配位形成超共軛結構后,整個黃酮母核的共軛體系增大,電子的離域程度增加,使得配合物更容易提供電子,便于與·OH結合終止自由基的鏈式反應。其次,黃酮配體與銅(II)形成配合物以后,母環中的C—C、C—H鍵的鍵長會增加,整個分子的穩定性降低,抗氧化活性會增加[17]。另外,配合物中的中心銅(II)所帶正電荷的離域作用會影響配體中羥基質子的正電荷,并且中心銅(II)由于帶有較大的正電荷,呈現出較強的成鍵能力,在一定程度上增強了配合物的抗氧化活性。配合物1清除·OH的IC50(158 μmol/L)小于配合物2的IC50(129 μmol/L)(圖7),這一順序與金雀異黃酮、山奈酚清除·OH的活性大小順序一致,說明在清除·OH的過程中,黃酮配體起主要作用。

圖7 配合物清除·OH的IC50值Fig.7 IC50 values of the complexes to hydroxyl radicals

3 結論

本文在無水乙醇-水混合溶劑中,分別以金雀異黃酮和山奈酚為配體,合成了2個銅(II)配合物:[Cu(Gen)2(H2O)2]·3H2O(1)、[Cu(Kae)2(H2O)2]·1.5H2O(2)并且進行了表征。在配合物中,金雀異黃酮和山奈酚均以二齒配位的方式與中心銅離子配位,摩爾比為2∶1。