β1-AR/CMC-UPLC/MS聯(lián)用的分析方法篩選辛夷中的活性成分

程永杰,張府君,王 新,李曉妮*

(1山西藥科職業(yè)學(xué)院中藥系中藥教研室,太原 030031;2山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室;*通訊作者,E-mail:87134858@qq.com)

細(xì)胞膜色譜法(CMC)在藥學(xué)篩選活性成分研究中作用很廣泛,該法是將含藥物受體的細(xì)胞膜固定在硅膠載體表面,制備成細(xì)胞膜固定相(CMSP),利用液相色譜法研究流動(dòng)相中藥物與固定相上細(xì)胞膜相互作用的受體動(dòng)力學(xué)新方法[1]。此法中藥物不需要經(jīng)過提取和分離而可以直接在細(xì)胞膜色譜法模型上完成活性成分的篩選。

辛夷又稱望春玉蘭花(MagnoliabiondiiPamp.),臨床上主要用來治療急慢性鼻炎、過敏性鼻炎和其他的鼻炎[2],除此之外還有收斂作用、保護(hù)黏膜、改善局部血液循環(huán)、促進(jìn)分泌物的吸收以及抑菌、抗炎、降壓等其他藥理作用。β1腎上腺素受體(β1-AR)是心臟組織中腎上腺素受體的主要亞型,其基因表達(dá)變化與心衰、高血壓等心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展及治療密切相關(guān)[3]。鑒于此,本課題通過獲得細(xì)胞膜高表達(dá)β1-AR的細(xì)胞株,在此基礎(chǔ)上制備膜色譜柱,建立起β1-AR高表達(dá)的CMC系統(tǒng)[4],再利用β1-AR/CMC分析方法對(duì)辛夷的作用靶點(diǎn)進(jìn)行研究,篩選辛夷中潛在活性成分,為辛夷的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和治療高血壓新藥研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

大孔球形硅膠(青島美高集團(tuán)有限公司);中國倉鼠卵巢S亞型(CHO-S)細(xì)胞、高表達(dá)的β1-AR/CHO-S細(xì)胞由山西醫(yī)科大學(xué)藥物分析實(shí)驗(yàn)室提供;美托洛爾(Meto)、異丙腎上腺素(ISO)、地西泮(DZ)、辛夷脂素(Far)對(duì)照品(均購自中國藥品生物制品檢定所);辛夷藥材(購自國藥集團(tuán)山西分公司);色譜級(jí)甲醇(Fisher Scientific公司);純凈水(自制);石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯(天津四友化學(xué)試劑公司);其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

LC-10AT高效液相色譜儀,LC solution色譜工作站,日本島津;Waters ACQUITY UPLC三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(Waters Corp.,Manchester,UK);TU-1901雙光束紫外可見光分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;ZZXT-A型裝柱機(jī),大連日普利科技儀器有限公司;TGL-16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;pHS-25型pH計(jì),上海雷磁儀器廠;KQ-3200DE型超聲波清洗機(jī),昆山市超聲儀器有限公司;電子天平,北京賽多利斯天平有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取Meto、DZ、Far對(duì)照品5.00 mg,置于5 ml容量瓶中,加甲醇使溶解,甲醇加至刻度搖勻,即得濃度為1 mg/ml的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.1.2 辛夷供試品溶液的制備 取辛夷藥材100 g,粉碎,過40目篩,取約50 g,置圓底燒瓶中,加95%的乙醇400 ml浸泡,60 min后,連續(xù)回流提取3次,每次90 min,合并提取液,真空抽濾后蒸干,即得辛夷提取物。取辛夷提取物100 mg,置100 ml容量瓶中,加甲醇使溶解,甲醇加至刻度搖勻,即得濃度為1 mg/ml的供試品溶液,避光放置在4 ℃條件下保存。

2.1.3 β1-AR/CMC色譜柱及CHO-S/CMC色譜柱的制備 在4 ℃下,將生長狀態(tài)良好的高表達(dá)β1-AR/CHO-S細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化后,在1 000 r/min條件下,離心10 min,過濾,將沉淀與低滲液10 ml混合,超聲20 min,再在12 000×g條件下離心10 min,過濾,取沉淀與生理鹽水5 ml混勻,得到高表達(dá)的β1-AR/CHO-S細(xì)胞膜懸液[5]。依據(jù)參考文獻(xiàn)[6]將高表達(dá)的β1-AR/CHO-S細(xì)胞膜懸液與活化硅膠混合制備β1-AR/CMC色譜柱。將制備好的β1AR/CMC色譜柱連接至色譜系統(tǒng)使用。

2.1.4 β1-AR/CMC分析 色譜柱:高表達(dá)β1-AR/CMC色譜柱(10 mm×2 mm,5 μm);檢測波長:美托洛爾為275 nm,地西泮為254 nm,辛夷提取物、辛夷脂素283 nm;流動(dòng)相:5 mmol/L醋酸鹽緩沖液(pH 7.4);流速:0.2 ml/min;柱溫:37 ℃;進(jìn)樣量20 μl;將細(xì)胞膜色譜柱與液相色譜連接,用5 mmol/L醋酸鹽緩沖液(pH 7.4)平衡60 min后再進(jìn)行進(jìn)樣分析,整個(gè)分析過程均保持在細(xì)胞膜色譜柱的活性期內(nèi)進(jìn)行。

用96孔板分別收集β1-AR細(xì)胞膜色譜柱的流出組分,合并,用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮、干燥,用于UPLC/MS分析。

2.1.5 UPLC/MS分析 色譜條件:色譜柱為ACQUITY UPLCTMBEH C18柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);以乙腈為流動(dòng)相A,以0.2%乙酸溶液為流動(dòng)相B,梯度洗脫;流速0.2 ml/min;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量5 μl。

質(zhì)譜條件:噴霧電壓3.5 kV,離子源為ESI+;除溶劑氣體為N2,除溶劑溫度為350 ℃;離子源溫度120 ℃。

2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 β1-AR/CMC方法可行性分析 取Meto與DZ的混合對(duì)照品溶液注入β1-AR/CMC色譜系統(tǒng),結(jié)果見圖1。R0和R1分別為β1-AR/CMC色譜系統(tǒng)的未保留組分與保留組分(圖1A),收集各流出組分,濃縮、蒸干,按2.1.2方法制備后注入U(xiǎn)PLC/MS系統(tǒng)進(jìn)行鑒定,質(zhì)譜數(shù)據(jù)(見圖1B、1C)表明,R0-1為陰性藥物地西泮,R1-1為陽性藥物美托洛爾。

2.2.2 對(duì)辛夷提取物的篩選結(jié)果 圖2結(jié)果顯示辛夷提取物在β1-AR/CMC柱上有明顯的保留峰(見圖2A),而在純硅膠色譜柱上無保留(見圖2B),收集R1的流出液,濃縮、蒸發(fā)、用適量甲醇制備后注入U(xiǎn)PLC/MS進(jìn)行分析,結(jié)果見圖2C。從UV和MS(見圖2D)及文獻(xiàn)所報(bào)道的數(shù)據(jù)[7,8]分析,可知R1中的活性成分為辛夷脂素Far。

圖1 混合對(duì)照品的β1-AR/CMC-offline-UPLC/MS色譜圖Figure 1 Chromatograms of mixed standard solution with β1-AR/CMC-offline-UPLC/MS method

圖2 采用β1-AR/CMC-Offline-UPLC/MS法分析辛夷脂素提取液獲得的色譜圖Figure 2 Chromatograms of Far extract with β1-AR/CMC-offline-UPLC/MS method

3 討論

現(xiàn)代藥理研究表明,辛夷的水或醇提取物具有一定降壓作用,其降壓機(jī)制與擴(kuò)張血管、阻斷神經(jīng)節(jié)及抑制心臟有關(guān)[9,10]。本課題利用建立的β1-AR/CMC-offline-UPLC方法篩選出辛夷脂素是辛夷中與心肌細(xì)胞膜有結(jié)合的活性成分,且通過β1-AR/CMC的分析,確定了辛夷脂素能與β1-AR相互作用。通過細(xì)胞膜色譜法篩選,研究者可以獲得活性化合物。同時(shí),受體動(dòng)力學(xué)認(rèn)為藥物一般是通過藥物與受體或者藥物與相應(yīng)的分子通道相互作用發(fā)揮藥理作用[11]。利用細(xì)胞膜色譜模型篩選的活性化合物一般在藥理試驗(yàn)驗(yàn)證中具有較強(qiáng)的生物活性[12]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,辛夷脂素在β1-AR/CMC模型上具有和陽性藥物美托洛爾相似的保留特點(diǎn),提示其可以作用β1-AR,可能是β1-AR拮抗劑。

細(xì)胞膜色譜模型是一種體外研究方法,一定程度上能體現(xiàn)藥物與受體作用的情況,而藥物發(fā)揮其藥效作用是個(gè)復(fù)雜的過程,因此有必要進(jìn)行藥理實(shí)驗(yàn),以進(jìn)一步評(píng)價(jià)、驗(yàn)證篩選出的活性化合物的藥理作用。