ILK、E-cadherin及Twist在膀胱癌中的表達及意義

高 娟,董兵衛,張渭波,李 卓*

(1西安醫學院第一附屬醫院檢驗科,西安 710077;2咸陽市中心醫院病理科;*通訊作者,E-mail:lizhuo721@163.com)

膀胱癌(urothelial cell carcinoma,UCC)占膀胱腫瘤系統的80%-90%左右,60%左右的患者手術后會有復發的可能。上皮間質轉化[1](epithelial mesenchymal transition,EMT)是多細胞胚胎發育與器官形成中的基礎過程,近年來研究發現[2],EMT在腫瘤發生、發展與轉移過程中起著重要的作用,EMT使沒有侵襲、遷移能力的細胞獲得浸潤能力并最終轉移到其他組織和器官,并再次通過間質上皮轉化定植形成轉移灶。

整合素連接激酶(intergrin-linked kinase,ILK)是一個59 kDa的細胞內信號蛋白,它在胞內的兩個靶向催化位點是蛋白激酶B和糖原合成酶激酶-3。研究顯示,ILK與神經膠質瘤等的發生、分化及侵襲轉移密切相關[3],實驗證實,運用siRNA ILK抑制ILK的活性,在膀胱癌細胞中,可以抑制細胞的生長、遷移、侵襲和血管生成[4]。ILK是哺乳動物細胞中主要的信號傳導分子,在人類腫瘤發生EMT的過程中起著重要作用,但是其機制目前并不清楚[5]。上皮性鈣黏附蛋白(E-cadherin)的下調與神經性鈣粘附蛋白(N-cadherin)的上調是EMT的主要特征之一。研究表明下調ILK能使E-cadherin在體內外的表達均升高,而E-cadherin的低表達是EMT的重要標志[6-7],通過與靶基因啟動子結合,誘導EMT的發生,促使腫瘤細胞發生侵襲與轉移[8];而堿性螺旋環轉錄因子(Twist)通過抑制細胞凋亡與分化,誘導細胞上皮間質化轉變,其高表達與腫瘤的轉移與預后相關[9]。至今為止,ILK、E-cadherin及Twist在膀胱癌EMT中的作用未見報道,本文應用免疫組化SP法檢測ILK、E-cadherin及Twist在膀胱癌組織中的表達,分析三者對膀胱癌EMT的影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2015-06～2017-12咸陽市中心醫院病理科膀胱腫瘤手術切除新鮮標本,離體5 min內進行取材,病理證實均為原發性膀胱癌,并無化療、放療。取62例(其中男50例,女12例)膀胱癌標本,患者年齡為49-81歲,平均年齡65歲,依據WHO(2004)泌尿系統腫瘤的病理分級標準分類:高分化28例,低分化34例;另取25例(其中男20例,女5例)癌旁正常組織作為陰性對照,年齡53-85歲,平均年齡69歲。所有標本用10%中性福爾馬林固定,常規脫水、透明、浸蠟、包埋,4 μm厚連續切片。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 免疫組織化學、DAB染色試劑盒均由博奧森公司提供,兔抗人ILK多克隆抗體由Santa Cruz公司提供;兔抗人E-cadherin及Twist多克隆抗體均由邁新生物技術有限公司提供。

1.2.2 方法 免疫組織化學采用SP法進行染色,一抗兔抗人ILK、E-cadherin及Twist多克隆抗體稀釋濃度均為1 ∶100。嚴格按照試劑盒說明書進行操作,用已知陽性切片作為陽性對照,以0.01 mol/L PBS(pH 7.4)替代一抗作為陰性對照。

1.2.3 結果判斷 染色結果評定:ILK和Twist蛋白主要在細胞質內表達,以細胞漿中出現棕黃色染色為陽性染色,E-cadherin蛋白以細胞膜或細胞質出現棕黃色染色為陽性染色,評分標準:①隨機選擇計數1 000個細胞,計算陽性細胞百分數:陽性細胞百分數<10%為1分,10%-50%為2分,>50%為3分。②染色強弱計分:陰性為0分,淺黃色為1分,黃色為2分,棕黃(褐)色為3分。按照“陽性細胞百分數×染色強弱”計總分:0-1分為陰性(-),2-4分為弱陽性(+),6-8分為陽性(++),9分為強陽性(+++)。陽性判定標準為+,++,+++。

1.3 統計學分析

采用SPSS 18.0統計軟件進行統計學分析,兩組間比較選用χ2檢驗(包括Fisher精確概率法)。相關分析采用Spearman等級相關分析法處理統計結果。

2 結果

2.1 膀胱癌和癌旁正常組織中ILK、E-cadherin及Twist的表達

SP染色結果顯示,ILK及Twist在膀胱癌中的表達較癌旁正常組織高,E-cadherin在膀胱癌中的表達較癌旁正常組織低(見圖1)。ILK在膀胱癌和癌旁正常組織中的表達率分別為54.8%(34/62)和16.0%(4/25),兩組相比差異具有統計學意義(χ2=10.9,P<0.05)。E-cadherin的陽性表達分別為32.3%(20/62)和72.0%(18/25),兩組相比差異具有統計學意義(χ2=11.4,P<0.05)。Twist的陽性表達分別為64.5%(40/62)和4.0%(1/25),兩組相比差異具有統計學意義(χ2=26.2,P<0.05,見表1)。

表1ILK、E-cadherin及Twist在膀胱癌和癌旁正常組織中的表達

Table1ExpressionofILK,E-cadherinandTwistinbladdercancerandadjacentnormaltissues

組別nILKE-cadherinTwist膀胱癌組織6234(54.8)20(32.3)40(64.5)癌旁正常組織25 4(16.0)18(72.0)1(4.0) χ210.9 11.4 26.2 P0.0010.0010.001

2.2 膀胱癌病理分級與ILK、E-cadherin及Twist表達的關系

膀胱癌不同病理分級ILK的表達分別為:高分化39.3%(11/28),低分化67.6%(23/34),兩組相比差異具有統計學意義(χ2=4.9,P<0.05);E-cadherin在膀胱癌不同病理分級中的表達分別為:高分化53.6%(15/28),低分化14.3%(5/34),兩組相比差異具有統計學意義(χ2=10.6,P<0.05);Twist在膀胱癌不同病理分級中的表達分別為:高分化53.6%(15/28),低分化73.5%(25/34),兩組相比差異具有統計學意義(χ2=2.7,P<0.05,見表2)。

A1. ILK在膀胱癌組織中陽性表達;A2. ILK在癌旁正常組織中弱陽性表達；B1. E-cadherin在膀胱癌組織中弱陽性表達;B2. E-cadherin在癌旁正常組織中強陽性表達；C1. Twist在膀胱癌組織中陽性表達;C2. Twist在癌旁正常組織中不表達圖1 ILK、E-cadherin及Twist在膀胱癌及癌旁正常組織中的表達 (SP,×100)Figure 1 Expression of ILK, E-cadherin and Twist in bladder cancer and adjacent normal tissues (SP,×100)

表2ILK、E-cadherin及Twist的表達與膀胱癌病理分級的關系

Table2TherelationshipbetweentheexpressionofILK,E-cadherinandTwistandthepathologicalgradeofbladdercancer

病理分級nILKE-cadherinTwist高分化2811(39.3)15(53.6)15(53.6)低分化3423(67.6)5(14.3)25(73.5)χ24.98710.6142.672P0.0240.0010.002

2.3 ILK、E-cadherin及Twist在膀胱癌中表達的相互關系

膀胱癌中E-cadherin與ILK表達呈負相關(r=-0.3,P<0.05,見表3),Twist與ILK表達呈正相關(r=0.4,P<0.05,見表3),E-cadherin與Twist表達亦呈負相關(r=-0.5,P<0.05,見表4)。

表3E-cadherin、Twist與ILK在膀胱癌中表達的關系

Table3RelationshipbetweenE-cadherin,TwistandILKexpressioninbladdercancer

ILKE-cadherinTwist+-rP+-rP+727-0.30.0012860.4 0.001-13151216

表4E-cadherin與Twist在膀胱癌中表達的關系

Table4RelationshipbetweenE-cadherinandTwistexpressioninbladdercancer

E-cadherinTwist+-rP+614-0.50.001-348

3 討論

研究發現,EMT與膀胱癌的侵襲、轉移密切相關,同時還與膀胱腫瘤分期、分級相關[10]。作為一種重要的EMT調控蛋白,ILK引起了廣泛的關注,它通過使腫瘤細胞獲得間質表型從而在多種腫瘤中介導了侵襲轉移[11]。過表達ILK蛋白引起它所介導的信號通路的改變,最終會導致細胞向惡性分化。E-cadherin是一種鈣依賴性跨膜蛋白,廣泛參與同型細胞間的黏附及細胞骨架的穩定,它的異常表達被認為與EMT的發生密切相關[12]。Le等[13]研究報道,在乳腺癌患者E-cadherin蛋白表達明顯降低。研究發現,顯著降低ILK的表達后,EMT相關的蛋白分子E-cadherin表達增加,抑制腫瘤轉移,使腫瘤細胞惡性程度降低[14]。本研究顯示,ILK在膀胱癌中的表達明顯高于癌旁正常組織,而E-cadherin的表達明顯低于正常組織,且E-cadherin在高分化癌中表達明顯高于低分化癌,并與ILK的表達呈負相關,提示E-cadherin表達下調誘發EMT,使細胞間的黏附作用削弱,從而使腫瘤細胞脫離原發灶,發生浸潤和轉移。

Twist是近年來倍受關注的癌基因之一,參與腫瘤細胞EMT過程,使腫瘤細胞通過適應周圍基質環境獲得新的上皮特性,形成轉移病灶,且這種轉移灶中的腫瘤細胞遷移、增殖的活性較原發腫瘤更強,并出現抗腫瘤藥物的活性[15]。在多種腫瘤的研究[16]中發現,Twist是腫瘤細胞發生EMT,并獲得遷徙、侵襲和轉移能力的主要誘導因子之一。Twist具有獨立的抑制E鈣黏蛋白表達,并上調纖連蛋白和N鈣黏蛋白的作用。Li等[17]研究乳腺癌MCF7細胞系和宮頸癌Hela細胞系中Twist的表達時發現,Twist高表達可誘導與EMT相關的細胞形態學變化。本文研究提示Twist在膀胱癌中的表達隨著腫瘤惡性程度的增加而增高,并與ILK的表達呈正相關,同時,隨著Twist的上調,E-cadherin表達出現下降,E-cadherin作為EMT過程中的關鍵因子,表明Twist1在膀胱癌中是通過E-cadherin最后發揮作用。因此,從本實驗中我們推測,三者在作用機制上可能存在某種聯系,通過相互調節,在膀胱癌EMT的發生、發展中發揮協同效應,構成膀胱癌惡性生物學行為的基礎。本課題組在后續實驗中將繼續探討三者的相互作用,為膀胱癌的診治提供更多的科學依據。