SASH1是乳腺癌預后的一個新的生物標志物

詹欽文,李 述,王 科,李 波*

(1重慶醫科大學附屬永川醫院骨科,重慶 402160;2重慶醫科大學附屬永川醫院檢驗科;*通訊作者,E-mail:cqeylibo@163.com)

乳腺癌是世界上女性癌癥相關死亡的第二大常見原因[1,2]。2012年全世界婦女中發生了大約170萬新發乳腺癌[2]。在2016年,美國大約有246 660例新發侵襲性乳腺癌病例,包括61 000例原位癌,其中有40 450例患者死亡[3]。乳腺癌也是中國大陸女性最常見的癌癥,發病率為268.6/100 000人,每年增加3.9%左右[4]。

SASH1作為SH3/SAM連接分子家族成員,已被鑒定是信號轉導過程中的一個新的腫瘤抑制因子和關鍵蛋白[5]。Ren等[6]報道,SASH1表達下調會抑制卵巢癌的生長、增殖和遷移,增強細胞凋亡。最近,Burgess等[7]報道SASH1對乳腺癌的進展具有亞型依賴性影響,并且與其預后相關。通過氯吡嗪處理恢復乳腺癌細胞SASH1蛋白的表達似乎會增加乳腺癌細胞的凋亡,這提示其可以作為乳腺癌治療的潛在生物靶點。此外,與正常乳腺上皮組織相比,74%的乳腺腫瘤組織中SASH1的表達明顯下降[8]。

微陣列技術的發展徹底改變了RNA和DNA的研究模式,并且已成為生物學和生物醫學研究的重要組成部分[9]。通過檢索Pubmed等數據庫發現,目前關于SASH1的研究很少,特別是SASH1與乳腺癌預后關系的研究更少。因此,本研究通過生物信息學分析和免疫組織化學實驗,對乳腺癌患者中SASH1的表達和突變進行了深入的探討,以確定其在乳腺癌患者中的表達模式、潛在功能和預后價值。

1 材料和方法

1.1 Oncomine分析

Oncomine基因表達數據庫(www.oncomine.org)是一個在線癌癥微陣列數據庫,主要用于分析不同腫瘤中SASH1的轉錄水平。將臨床腫瘤標本中SASH1 mRNA表達水平與正常對照組中的mRNA表達水平進行比較,使用Students’t檢驗生成P值。P值和fold change值的界限值分別定義為P<0.05和fold change>2。

1.2 Breast cancer gene-expression miner v4.0 分析

Breast cancer gene-expression miner v4.0(bcGenExMiner v4.0)由36個帶注釋的基因組數據集和3個統計挖掘函數組成。表達模塊于2016年3月29日添加,這個數據庫主要通過臨床病理參數來比較靶基因的表達水平,如激素受體、淋巴結狀態等。預后模塊評估了候選基因對乳腺癌患者中預后的影響,并為乳腺癌的治療提供了潛在的預后標志物。

1.3 免疫組織化學法分析乳腺癌組織中SASH1表達水平及其與臨床病理參數的關系

選取2016-05～2018-06重慶醫科大學附屬永川醫院收治的80例乳腺癌患者手術切除組織標本和29例癌旁正常組織,均通過病理檢測確診。

將乳腺癌患者腫瘤組織和癌旁正常組織固定于10%甲醛溶液中(4 ℃,24 h)。石蠟包埋后切成5 μm厚的切片。然后于56 ℃烘箱過夜、二甲苯和梯度乙醇溶液脫蠟水化。抗原修復后滴加3% H2O2去離子水覆蓋組織15 min,試劑A(封閉用正常山羊血清工作液)室溫封閉30 min,然后滴加兔抗人SASH1多克隆抗體(稀釋比例為1 ∶50,購自美國Novus公司)37 ℃反應1 h,4 ℃過夜。滴加試劑B(生物素標記的即用型山羊抗兔IgG)37 ℃反應30 min。滴加試劑C(辣根過氧化物酶標記的鏈酶卵白素工作液)37 ℃反應15 min,DAB顯色(免疫組織化學實驗檢測試劑盒購自無錫傲銳東源生物科技有限公司)。在顯微鏡下觀察染色結果,并用PBS終止反應。蘇木精對比染色,45 ℃ ddH2O浸泡返藍。最后用中性樹脂封固,在顯微鏡下觀察陽性結果并拍照。根據腫瘤細胞染色強度評分,共4級:0分(-),1分(+),2分(++),3分(+++)。

1.4 The Kaplan-Meier Plotter分析

使用在線數據庫Kaplan-Meier Plotter(www.kmplot.com)評估SASH1 mRNA表達水平對乳腺癌患者預后的價值,其中包含3 951名臨床乳腺癌患者的基因表達數據和生存相關的信息。為了分析乳腺癌患者的無復發生存時間(recurrence-free survival,RFS)和總體生存時間(overall survival,OS),通過中位表達水平(高表達與低表達)將患者樣本分成兩組,并通過Kaplan-Meier生存圖評估風險比(HR)、95%置信區間(95%CI)和log-rankP值。

1.5 TCGA data and cBioPortal分析

癌基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)包括30種不同腫瘤的測序和病理學數據結果。選取1 105例有病理報告的The breast invasive carcinoma(TCGA,Provisional)數據集,進一步通過cBioPortal分析SASH1突變情況。基因組譜包括來自GISTIC的突變和拷貝數變異(copy-number variance,CNV),mRNA表達z-分數(RNA Seq V2 RSEM)和蛋白質表達z分數(CPTAC)。同時根據cBioPortal的Kaplan-Meier生存曲線計算SASH1突變的總體生存時間和無病生存時間(disease-free survival,DFS)。

1.6 統計學方法

采用SPSS 16.0統計學軟件對各實驗結果進行統計分析。分析乳腺癌組織的免疫組織化學檢測結果以及SASH1表達與乳腺癌臨床指標的關系時用χ2檢驗;以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SASH1在乳腺癌病人中轉錄水平

使用Oncomine數據庫對腫瘤中SASH1的轉錄水平與正常樣本中的轉錄水平進行比較,發現其中18個數據集的乳腺癌患者的SASH1 mRNA表達明顯下降,僅在1個數據集中SASH1 mRNA表達上調(Finak Breast數據集的浸潤性乳腺癌)(見圖1)。在Curtis Breast數據集,與正常樣本相比,在所有類型的乳腺癌中均發現SASH1的低表達,且差異有統計學意義(P<0.05)。浸潤性導管乳腺癌的差異倍數為-2.980,浸潤性小葉乳腺癌的差異倍數為-2.480,浸潤性導管和浸潤性小葉乳腺癌的差異倍數為-2.709,管狀乳腺癌的差異倍數為-2.537,粘液性乳腺癌的差異倍數為-2.948,髓樣乳腺癌的差異倍數為-3.255和乳腺導管原位癌的差異倍數為-2.149(見表1)。

2.2 乳腺癌患者SASH1 mRNA水平和臨床病理參數的關系

在bc-GenExMiner v4.0在線數據庫中,根據不同的臨床病理學參數,比較乳腺癌患者中SASH1 mRNA的表達差異。以51歲為界限,將病人分成兩組,結果發現大于51歲的患者的SASH1 mRNA表達明顯上調(P<0.001)。同時,以40歲和70歲為界限,將病人分為三組(<40歲,40-70歲和>70歲),結果發現大于70歲的老年患者的SASH1 mRNA表達上調(P<0.001)。以Her2受體陰陽性為界限,分析結果發現Her2陽性的患者的SASH1 mRNA表達上調(P=0.028)。而分別以雌激素受體和孕激素受體陰陽性以及結節狀態為界限,發現SASH1 mRNA的表達差異無統計學意義(P值分別為0.314,0.171和0.377,見圖2)。

該圖由Oncomine生成,表明了差異有統計學意義(P<0.05)的mRNA的過表達(紅色)或下調(藍色)的數據集的數量圖1 SASH1在不同腫瘤中的轉錄水平Figure 1 The transcription levels of SASH1 in different types of cancers

三陰乳腺癌是一種雌激素受體、孕激素受體和Her2受體均陰性的乳腺癌,本研究發現三陰乳腺癌與非三陰乳腺癌患者的SASH1 mRNA的表達差異無統計學意義(P=0.273)。在斯卡夫布魯姆和理查森等級狀態(Scarff Bloom & Richardson grade status,SBR)的病理分級中,我們發現,SBR等級越低的患者SASH1 mRNA表達水平越高(SBR1>SBR2>SBR3),且差異有統計學意義(P<0.001,見圖2)。

表1不同類型的乳腺癌和乳腺正常組織之間SASH1表達在轉錄水平上的顯著變化(ONCOMINE數據庫)

Table1ThesignificantchangesofSASH1expressionintranscriptionlevelbetweendifferenttypesofbreastcancerandnormalbreasttissues(ONCOMINEdatabase)

SASH1表達類型 乳腺癌vs正常組織差異倍數PT檢驗值 數據集高表達間質浸潤性乳腺癌3.5729.37×10-2315.786Finak Breast低表達浸潤性導管乳腺癌-2.6665.03×10-13-10.667Zhao Breast低表達小葉乳腺癌-2.1612.50×10-7-7.272Zhao Breast低表達浸潤性導管乳腺癌-2.9801.27×10-111-40.280Curtis Breast低表達浸潤性小葉乳腺癌-2.4808.68×10-5319.841Curtis Breast低表達浸潤性小葉乳腺癌和導管乳腺癌-2.7095.60×10-36-17.550Curtis Breast低表達乳腺癌-3.3227.49×10-9-11.318Curtis Breast低表達小葉乳腺癌-2.5375.56×10-30-16.528Curtis Breast低表達黏液性乳腺癌-2.9485.10×10-21-14.645Curtis Breast低表達髓質乳腺癌-3.2552.10×10-14-12.151Curtis Breast低表達浸潤性乳腺癌-2.9292.51×10-8-8.188Curtis Breast低表達原位導管乳腺癌-2.1492.00×10-4-5.322Curtis Breast低表達導管乳腺癌-3.4931.59×10-11-9.175Richardson Breast 2低表達間質浸潤性導管乳腺癌-2.0865.25×10-5-4.931Ma Breast 4低表達浸潤性導管乳腺癌-3.0142.38×10-44-19.088TCGA Breast低表達浸潤性乳腺癌-2.2856.02×10-20-10.732TCGA Breast低表達浸潤性小葉乳腺癌-2.0736.71×10-9-6.798TCGA Breast低表達間質浸潤性導管乳腺癌-2.4942.18×10-4-4.941Karnoub Breast低表達浸潤性乳腺癌-2.9687.67×10-4-8.135Gluck Breast

括號內數值為相應組患者數圖2 SASH1 mRNA的表達水平與乳腺癌臨床病理參數的關系Figure 2 The relationship between mRNA expression of SASH1 and clinicopathological parameters of breast carcinoma

2.3 SASH1在乳腺癌患者中低表達及與臨床病理學參數的關系

為了驗證SASH1在乳腺癌中的表達水平及與臨床病理參數的關系,課題組選取了80例乳腺癌患者標本和29例癌旁正常組織,進行免疫組織化學法分析，結果證實,29例癌旁正常組織中SASH1明顯高表達(22/29,75.9%),而在80例乳腺癌組織中SASH1明顯低表達(67/80,83.8%),SASH1表達差異有統計學意義(P<0.05,見圖3)。這一發現也與“結果2.1”中Oncomine數據庫所發現的SASH1 mRNA在大多數乳腺癌患者中低表達的結果一致。

A.正常組織中SASH1表達水平;B-E.分別為乳腺癌組織中SASH1表達陰性、弱陽性、中等陽性和強陽性圖3 免疫組織化學法分析SASH1在乳腺癌組織和癌旁正常組織中的表達情況 (DAB,×200) Figure 3 Immunohistochemical analysis of SASH1 protein expression in breast cancer tissues andnormal breast tissues (DAB,×200)

同時,通過分析SASH1蛋白表達水平和乳腺癌患者臨床病理學參數的關系來驗證bc-GenExMiner v4.0在線數據庫得出的SASH1 mRNA水平與臨床病理學參數的關系是否可靠。結果證實80例進行淋巴結清掃的乳腺癌組織中,淋巴結轉移陰性的SASH1低表達率略高于淋巴結轉移陽性組,但無統計學差異(88.1%vs78.9%,P>0.05);同樣以51歲為界將患者分成兩組,結果發現≤51歲SASH1低表達的患者明顯高于SASH1高表達患者(SASH1低表達和高表達分別為61例和2例)。然而大于51歲的患者中,SASH1高表達的患者數量明顯高于低表達患者(SASH1高表達和低表達分別為11例和6例),并且這一表達的不一致性的差異有統計學意義(P<0.01);同時,根據腫瘤面積和腫瘤分級進行分組討論時也發現SASH1低表達與其相關(P<0.05),并且腫瘤分級越低SASH1高表達率越高,Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ級的SASH1高表達率分別為32.0%，11.1%和5.3%(見表2)。這一發現也與“結果2.2”中bc-GenExMiner v4.0在線數據庫所發現的乳腺癌患者SASH1 mRNA表達水平與臨床病理學的關系相對應。

2.4 SASH1高表達提高乳腺癌患者的生存時間

Kaplan-Meier曲線分析發現,在SASH1 mRNA表達水平和乳腺癌預后的3個數據集中,SASH1高表達均能延長患者的RFS,提高患者的預后,且差異有統計學意義(P<0.05),226022-at數據集、213236-at數據集和41644-at數據集的HR分別為0.78,0.88和0.87;然而,SASH1高表達雖然可以延長患者的OS,但差異無統計學意義(P>0.05,見圖4)。

表2乳腺癌組織中SASH1蛋白表達與乳腺癌患者臨床病理參數的關系

Table2AssociationofSASH1expressionwiththeclinicalparametersofbreastcancerpatients

臨床病理參數nSASH1低高卡方檢驗值P淋巴結轉移1.23>0.05 陽性38308 陰性42375腫瘤直徑7.96<0.05 ≤1 cm18153 1.1-2 cm24168 2.1-3 cm24231 >3 cm1091組織學分級6.94<0.05 Ⅰ25178 Ⅱ36324 Ⅲ19181年齡37.24<0.01 ≤51歲63612 >51歲17611

2.5 SASH1突變不會影響乳腺癌患者的預后

在1 098例乳腺癌標本中,有67例發生了突變(6%)(見圖5A)。通過Kaplan-Meier曲線分析發現,SASH1突變不會影響乳腺癌患者OS和DFS,說明SASH1突變與否都不會改變患者的預后(見圖5)。

圖4 Kaplan-Meier分析乳腺癌患者中SASH1mRNA表達水平的預后價值Figure 4 The prognostic value of SASH1 mRNA level in BC patients by Kaplan-Meier plotter

圖5 SASH1基因突變對乳腺癌患者預后影響的cBioPortal分析Figure 5 Analysis of the influence of SASH1 gene mutation on the prognosis of patients with breast cancer by cBioPortal

3 討論

在過去的幾十年里,乳腺癌的治療有了很大改善,但在澳大利亞、美國和英國等發達國家都仍有15%-20%的患者術后生存時間小于10年[6]。關于這方面的花費占據了公共衛生部門有關癌癥相關的發病率和死亡率成本的很大一部分。對于當前一線治療無效的腫瘤其治療可能更復雜[10]。未來的疾病控制將取決于對疾病分子生物學的更多了解,從而確定與診斷相關的基因的新型個性化醫療方法[11]。

SASH1作為一種抑癌基因已有報道,其高表達可能促進癌細胞的凋亡[8]。但關于SASH1與乳腺癌患者預后方面的研究還非常少,通過檢索Pubmed數據庫僅發現14篇SASH1與乳腺癌關系的研究,這些文章絕大多數僅僅研究了SASH1與乳腺癌發生發展的關系,并沒有去進一步探討SASH1對乳腺癌患者預后的影響。

本研究通過生物信息學技術,利用Oncomine、Breast cancer gene-expression miner v4.0、Kaplan-Meier Plotter、TCGA data and cBioPortal等在線數據庫,結合免疫組織化學實驗綜合分析了SASH1表達水平和乳腺癌患者的關系。

Yang等[12]證實,SASH1表達水平與膠質瘤WHO分級密切相關。在121個病例中,SASH1低表達占66.9%,且其中大多數為Ⅲ-Ⅳ級,而33.1%的SASH1高表達的病例中大多數為Ⅰ-Ⅱ級。這說明SASH1表達水平與膠質瘤分級密切相關,在較低惡性程度時表現出較高的表達,隨著惡性程度的增加而顯著下降。原發性肝癌和甲狀腺腫瘤中,SASH1 mRNA表達水平明顯降低[13]。與相應正常組織比較,50例乳腺癌組織標本中有37例(74%)的SASH1表達明顯下調[14]。Gong等[8]研究也發現,與對照組相比,乳腺癌患者中SASH1的陽性率顯著降低(63/186,33.9%)。這些研究都表明了SASH1在乳腺癌的發生發展過程中扮演了一個關鍵角色。我們通過Oncomine數據庫進行基因差異性表達分析發現,與正常組織相比,乳腺癌組織中SASH1 mRNA的表達明顯下降,18個數據集的SASH1 mRNA低表達,1個數據集的SASH1 mRNA高表達,差異有統計學意義(見圖1，3和表1)。因此,這一研究結果表明乳腺癌組織中SASH1 mRNA表達下調。

李述等[5]證實SASH1低表達與乳腺癌的轉移和分級呈正相關,而與淋巴結轉移無關。同時,一些研究也揭示SASH1表達下降與腫瘤大小、侵襲性生長、轉移和生存率低有關[13-15]。SASH1表達增強與U251膠質瘤細胞侵襲能力降低有關[12]。從組織學類型上看,SASH1表達陽性率在浸潤性導管癌、浸潤性小葉癌、黏液癌和浸潤性篩狀癌中無統計學差異[8]。Burgess等[7]最近報道了在雌激素受體陽性和陰性乳腺癌中SASH1表達的存在顯著差異,但人類表皮生長因子受體2(HER2)陽性和陰性乳腺癌之間卻沒有發現SASH1陽性率存在統計學差異。以上研究都表明SASH1的表達水平可能與乳腺癌患者的臨床病例參數有關。本研究通過bc-GenExMiner v4.0在線數據庫和免疫組織化學實驗分析發現,在Her2陽性的乳腺癌中SASH1 mRNA表達明顯增加,而這一現象卻沒有在雌激素受體陽性或孕激素受體陽性的病人中觀察到,在這類病人中,SASH1 mRNA水平不存在統計學差異。通過對SBR與SASH1 mRNA表達水平之間關系的分析,得出SASH1表達水平越高,SBR(乳腺癌組織學分級)等級越低,病人惡性程度越低。同時,統計學分析也發現,SASH1表達水平與患者年齡密切相關,在老年患者中,SASH1表達水平明顯增加,這一發現也與臨床上乳腺癌常發生于中青年患者的現象符合(見圖2和表2)。

Zhou等[16]研究發現SASH1表達下調與胃癌預后差有關。但總的來說,關于SASH1表達與腫瘤患者預后關系的研究還很少。特別是SASH1表達與乳腺癌患者預后的研究就更少[17]。本研究通過Kaplan-Meier曲線發現,在3個數據集中SASH1高表達均能延長乳腺癌患者的RFS,提高患者的預后,且差異有統計學意義(P<0.05,226 022-at,213 236-at,41 644-at的HR分別為0.78,0.88,0.87),說明SASH1高表達是一個保護因素,可以促進癌細胞凋亡,抑制癌細胞侵襲和遷移。反之,腫瘤病人中SASH1表達下調會加速腫瘤轉移,縮短病人生存時間,對病人預后不利。當我們通過cBioPortal數據庫分析SASH1突變是否會影響乳腺癌預后時,結果發現SASH1突變與否,患者的OS和DFS的變化無統計學差異。這一發現與本研究前面的結論相悖,其原因是SASH1突變不僅有SASH1 mRNA表達上調和下調。在本研究中,我們發現有6%的乳腺癌病人SASH1發生了突變,其中包括錯義突變、擴增、缺失、mRNA上調和蛋白上調,因此SASH1突變生存曲線包含的病人不僅是SASH1 mRNA表達上調的,還包括其他突變類型病人,如果要明確其他突變是否會影響病人的預后,尚需進一步的臨床試驗來證實。

在本研究中,我們系統地分析了SASH1在乳腺癌中的表達和預后價值,從而更好地理解了乳腺癌的分子生物學異質性和復雜性。我們的發現進一步證實SASH1作為一個抑癌基因在乳腺癌中低表達,SASH1低表達將導致患者預后不良。本研究也揭示了SASH1是乳腺癌治療的一個潛在生物靶點,同時也是監測乳腺癌患者預后的一個潛在生物標志物,能為患者預后提供一個更準確的判斷。