化合物968對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞的增殖和凋亡的影響及其機(jī)制

劉亞明,葛賢明,郭 濱,甄 誠(chéng),魏 芳,韋穎梅,劉 浩

(蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,安徽省生化藥物工程技術(shù)研究中心,蚌埠 233030;*通訊作者,E-mail:liuhao6886@foxmail.com;#共同通訊作者,E-mail:bbmcwym@163.com)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是以滑膜中的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和增殖為特征的系統(tǒng)性自身免疫性疾病[1],致殘率高,發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。有研究表明:在RA疾病的發(fā)生發(fā)展中活化的成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞起著至關(guān)重要的作用,其通過(guò)產(chǎn)生炎癥介質(zhì)而導(dǎo)致滑膜炎癥和軟骨損傷[2]。近年來(lái),靶向促炎細(xì)胞因子和免疫細(xì)胞的生物療法的發(fā)展大大改善了RA的治療,然而一些患者對(duì)這些治療仍然耐受。因此尋求抑制RA-FLS增殖的新療法替代或補(bǔ)充現(xiàn)有的RA治療顯得尤為重要。正常細(xì)胞能量供給主要依賴于氧化磷酸化,而腫瘤細(xì)胞則更多依賴于產(chǎn)能效率較低的糖酵解和谷氨酰胺代謝[3,4]。由糖酵解途徑產(chǎn)生的丙酮酸被轉(zhuǎn)化為乳酸鹽,而不是用于三羧酸循環(huán),從而使進(jìn)入TCA的底物不足,難以維持后續(xù)物質(zhì)的合成。此時(shí),腫瘤細(xì)胞會(huì)通過(guò)大量的攝入谷氨酰胺回補(bǔ)TCA循環(huán)[5,6]。大量研究已經(jīng)證明靶向能量代謝為腫瘤的治療提供了新的治療策略[6-10]。而相關(guān)研究表明,在富含氧自由基、NO和細(xì)胞因子的微環(huán)境中,RA-FLS表現(xiàn)出多種腫瘤細(xì)胞樣特征[11],化合物968是谷氨酰胺酶1(glutaminase 1,GLS1)抑制劑[12],能夠特異性抑制谷氨酰胺代謝,由于GLS1在RA-FLS細(xì)胞中呈高表達(dá),且谷氨酰胺缺乏實(shí)驗(yàn)可抑制RA-FLS的生長(zhǎng)[13]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究化合物968對(duì)RA-FLS細(xì)胞增殖和相關(guān)蛋白的表達(dá)的影響,并探究其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司,胎牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技公司,化合物968購(gòu)自美國(guó)MedChemExpress(MCE)公司,MTT購(gòu)自Biosharp公司,Annexin-Ⅴ/PI雙染試劑盒購(gòu)自貝博生物公司,Mcl-1、Bax、β-actin抗體購(gòu)自Proteintech公司,HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG購(gòu)自博士德生物工程公司,DAPI試劑購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 細(xì)胞株

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞(RA-FLS)購(gòu)自BeNa Culture Collection(BNCC),蚌埠醫(yī)學(xué)院生化藥理研究室凍存。培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,置37 ℃、飽和濕度、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RA-FLS細(xì)胞接種于96孔板,每孔6×103個(gè)細(xì)胞。在培養(yǎng)箱中過(guò)夜,待細(xì)胞充分貼壁,棄去上清液,加入含有不同濃度(5,10,20,40,80 μmol/L)的化合物968的培養(yǎng)液,設(shè)置調(diào)零孔,每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔,分別培養(yǎng)24,48,72 h,然后每孔加入15 μl MTT溶液繼續(xù)孵育4 h,棄上清液,每孔加入150 μl二甲基亞砜,37 ℃溫箱孵育30 min,振蕩使結(jié)晶物充分溶解,用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)下的吸光度(OD)值,計(jì)算細(xì)胞的生存率。

1.4 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RA-FLS細(xì)胞以3.0×105/孔的密度接種于6孔板中。放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,分組加入不同濃度的化合物968,刺激細(xì)胞48 h,使用倒置顯微鏡觀察RA-FLS細(xì)胞形態(tài)的變化。

1.5 DAPI染色檢測(cè)細(xì)胞核的變化

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RA-FLS細(xì)胞以3.0×105/孔接種于6孔板培養(yǎng)24 h,使用不同濃度藥物分組給藥,藥物刺激細(xì)胞24 h,棄上清液,PBS洗滌2次,用4%多聚甲醛充分固定10 min,PBS洗滌3次,每孔加入600 μl DAPI染色液避光反應(yīng)15 min,棄上清,PBS洗滌3次,每次5 min,通過(guò)活細(xì)胞工作站觀察細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變化。

1.6 Annexin-Ⅴ/PI雙染法

收集細(xì)胞,離心后棄上清,用PBS洗滌細(xì)胞2次,然后用400 μl 1×Annexin Ⅴ結(jié)合液懸浮細(xì)胞,調(diào)整至1×106/ml濃度,轉(zhuǎn)至5 ml流式專用試管中,加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC染色15 min,再加入10 μl PI染色液?；靹蚝蟊芄夥跤? min,1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.7 Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Mcl-1、Bcl-2及Bax的表達(dá)

將RA-FLS細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔3×105個(gè)細(xì)胞,培養(yǎng)至80%匯合后,換含有濃度為10,20,40,80 μmol/L的化合物968的培養(yǎng)液刺激細(xì)胞。培養(yǎng)72 h收集細(xì)胞,每孔加入預(yù)冷的蛋白裂解液,冰上裂解30 min,提取細(xì)胞總蛋白,4 ℃離心30 min,上清液轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管中。采用BCA法定量。每組取60 μg蛋白進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜至PVDF膜,室溫封閉2-3 h,一抗4 ℃過(guò)夜,TBST洗膜3次,二抗室溫孵育2 h,TBST洗膜3次,加ECL顯影液,Bio-Rad凝膠成像儀成像。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 化合物968對(duì)RA-FLS細(xì)胞存活率的影響

MTT檢測(cè)結(jié)果表明,化合物968在5-80 μmol/L的濃度范圍可明顯降低RA-FLS細(xì)胞的存活率,隨著藥物濃度的增加,RA-FLS細(xì)胞的存活率顯著下降,且呈時(shí)間和濃度依賴性。經(jīng)計(jì)算,化合物968作用于RA-FLS細(xì)胞24,48,72 h的IC50值分別為48.45,35.66,20.95 μmol/L(見(jiàn)圖1)。

與0 μmol/L組相比,**P<0.01圖1 化合物968對(duì)RA-FLS細(xì)胞存活率的影響Figure 1 The proliferation rate of RA-FLS after treated with Compounds 968

2.2 化合物968對(duì)RA-FLS細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

0-80 μmol/L化合物968作用于RA-FLS細(xì)胞48 h在倒置顯微鏡下觀察,對(duì)照組(0 μmol/L)細(xì)胞生長(zhǎng)良好,細(xì)胞呈梭形,輪廓清晰,胞質(zhì)飽滿,而給藥組隨著給藥濃度增加,大量細(xì)胞表面有棕褐色絮狀物質(zhì)形成,并未見(jiàn)漂浮細(xì)胞,細(xì)胞密度隨著藥物濃度增加而減少,細(xì)胞增殖受到明顯抑制(見(jiàn)圖2)。

2.3 化合物968誘導(dǎo)RA-FLS細(xì)胞凋亡的作用

為了明確在RA-FLS細(xì)胞中化合物968是否可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,實(shí)驗(yàn)首先采用Annexin-Ⅴ/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡率。結(jié)果顯示,20,40,80 μmol/L化合物968作用于細(xì)胞24 h早期凋亡率分別為7.95%± 1.90%,14.6%± 1.70%,21.50%± 2.30%,顯著高于0 μmol/L組(2.80%± 0.60%,P<0.01,見(jiàn)圖3A)。

0-80 μmol/L化合物968處理細(xì)胞24 h,DAPI染色檢測(cè)化合物968作用細(xì)胞后細(xì)胞核的形態(tài)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,對(duì)照組細(xì)胞胞核均勻淡染,胞膜完整,胞核形態(tài)呈橢圓型,而給藥組細(xì)胞膜通透性增加,胞核濃集、邊緣化,隨著藥物濃度增加,細(xì)胞核出現(xiàn)濃染不規(guī)則致密的固縮形態(tài)逐漸增加,甚至有細(xì)胞核碎裂(見(jiàn)圖3B,白色三角形所示)。

2.4 化合物968對(duì)RA-FLS細(xì)胞Bax和Mcl-1蛋白表達(dá)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,20,40,80 μmol/L的化合物968作用于細(xì)胞48 h,抗凋亡蛋白Mcl-1的表達(dá)水平降低,促凋亡蛋白Bax的表達(dá)上調(diào)(見(jiàn)圖4)。這說(shuō)明,化合物968可以通過(guò)影響凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)從而引起RA-FLS細(xì)胞的凋亡。

圖2 化合物968對(duì)RA-FLS細(xì)胞形態(tài)的影響Figure 2 Effect of compound 968 on the morphology of RA-FLS cells

圖3 化合物968誘導(dǎo)RA-FLS細(xì)胞凋亡的作用Figure 3 The effect of compound 968 on apoptosis of RA-FLS cells

與0 μmol/L組相比,**P<0.01,***P<0.001圖4 RA-FLS細(xì)胞中Bax和Mcl-1的表達(dá)情況Figure 4 The expression level of Bax and Mcl-1 in RA-FLS cells

3 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞在富含氧自由基、一氧化氮和細(xì)胞因子的環(huán)境中具有自主生存的能力,類似于某些腫瘤的表型[13]。谷氨酰胺是細(xì)胞生長(zhǎng)和能量代謝中另一種很重要的碳源[14-16]。HeLa和基底型乳腺癌細(xì)胞等幾種癌細(xì)胞,相比葡萄糖更喜歡把谷氨酰胺作為其能量來(lái)源[11,17,18]。谷氨酰胺可作為合成大分子的前體,是呼吸的主要能量來(lái)源[19-21]。在腫瘤細(xì)胞中,由糖酵解途徑產(chǎn)生的丙酮酸被轉(zhuǎn)化為乳酸鹽,而不是用于三羧酸(TCA)循環(huán),從而使進(jìn)入TCA的底物不足,不足以維持后續(xù)物質(zhì)的合成。此時(shí),腫瘤細(xì)胞會(huì)通過(guò)大量的攝入谷氨酰胺[22],在谷氨酰胺酶的作用下將其轉(zhuǎn)化成谷氨酸,并在谷氨酰胺脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)變成α-酮戊二酸,從而回補(bǔ)TCA循環(huán)[4]。對(duì)于腫瘤細(xì)胞來(lái)說(shuō),谷氨酰胺是線粒體中最基本的底物,對(duì)維持線粒體的膜電位和完整性,特別是大分子物質(zhì)的合成上起重要作用[5]。為了補(bǔ)償這些變化并保持功能性TCA循環(huán),癌細(xì)胞通常升高對(duì)谷氨酰胺水平的依賴性[17,23]。相關(guān)研究表明,RA-FLS表現(xiàn)出幾種腫瘤細(xì)胞樣特征,如RA發(fā)炎的關(guān)節(jié)的微環(huán)境以低氧和低營(yíng)養(yǎng)濃度為特征[24]。有研究已經(jīng)闡述了RA-FLS中的代謝變化,如代謝組分析已顯示RA-FLS和骨關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞(OA-FLS)之間不同的代謝組學(xué)[25]。代謝組學(xué)結(jié)果表明,RA-FLS中糖代謝、脂肪分解和氨基酸代謝的改變與滑膜增生和炎癥有關(guān)。此外,葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(Glut1)、膽堿激酶、單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(MCT4)的抑制劑均已顯示出能抑制RA-FLS增殖和/或改善小鼠炎性關(guān)節(jié)炎[26-28]。從RA-FLS中發(fā)現(xiàn)的代謝組學(xué)改變揭示了風(fēng)濕性疾病發(fā)病的新機(jī)制,靶向代謝功能障礙可能會(huì)為RA的治療提供新的策略。

谷氨酰胺酶是谷氨酰胺代謝過(guò)程中的關(guān)鍵限速酶,它的抑制會(huì)導(dǎo)致進(jìn)入到TCA循環(huán)的底物不足。常見(jiàn)的谷氨酰胺酶抑制劑有BPTES和化合物968?；衔?68[12]是最近發(fā)現(xiàn)的第二類變構(gòu)GAC(glutaminase C)抑制劑,對(duì)抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)具有高度特異性。Bcl-2家族蛋白是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控因子,包括凋亡抑制蛋白和凋亡誘導(dǎo)蛋白,前者主要有Bcl-2、Mcl-1、Bcl-XL等,后者主要為Bax、Bak、Bad等[29]。

首先,我們通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)明確化合物968對(duì)RA-FLS細(xì)胞存活率的影響呈時(shí)間和濃度依賴性。

接著,我們使用倒置顯微鏡和DAPI染色分別觀察了化合物968對(duì)滑膜細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞核形態(tài)的影響,均發(fā)現(xiàn)化合物968可以顯著抑制RA-FLS細(xì)胞增殖。隨后,我們?yōu)榱嗣鞔_化合物968是否可以誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞凋亡,我們使用流式細(xì)胞儀采用雙染法檢測(cè)化合物968對(duì)滑膜細(xì)胞早期凋亡的影響,我們發(fā)現(xiàn)化合物968可以誘導(dǎo)RA-FLS細(xì)胞凋亡,且早期凋亡率隨著藥物濃度的增加而增加。最后,為了進(jìn)一步明確化合物968誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的可能性機(jī)制,我們通過(guò)Western blot檢測(cè)相關(guān)凋亡蛋白,結(jié)果表明,化合物968可以通過(guò)影響凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)從而引起類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞的凋亡。

綜合以上研究我們發(fā)現(xiàn):化合物968可以呈時(shí)間和濃度依賴性的降低RA-FLS細(xì)胞的存活率,并可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡,其可能的機(jī)制是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Mcl-1和Bax的表達(dá)。本研究我們可以發(fā)現(xiàn)靶向谷氨酰胺代謝可能會(huì)為RA的治療提供新的思路。