長鏈非編碼RNA RP13-753N3.1通過促進(jìn)CDKN1A基因的表達(dá)抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖和侵襲

張 軍,吳一凡,張茂娜,江 悅,張 弘*

(1武漢大學(xué)人民醫(yī)院鄂州醫(yī)院病理科,鄂州 436000;2三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)教研室;*通訊作者,E-mail:zmn0306@126.com)

膀胱癌是人類泌尿系統(tǒng)發(fā)生率最高的腫瘤,早期分子診斷和靶向治療對(duì)膀胱癌未來的治療發(fā)展尤其重要[1]。lncRNA是一類長度超過200個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA,通過促進(jìn)或抑制基因的表達(dá),參與調(diào)控細(xì)胞包括腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的增殖、凋亡、衰老、分化、轉(zhuǎn)移等一系列生物行為[2-5]。近年來不斷有新的lncRNA被證實(shí)參與了膀胱癌的發(fā)生發(fā)展。RP13-753N3.1是近期新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)lncRNA分子,但其在細(xì)胞中的作用尤其是在腫瘤細(xì)胞中的存在意義尚未明確。本研究通過檢測RP13-753N3.1在膀胱癌組織中的表達(dá),并以RP13-753N3.1表達(dá)量最低的膀胱癌細(xì)胞株為細(xì)胞模型,觀察了RP13-753N3.1對(duì)膀胱癌增殖和侵襲的影響,初步探討了RP13-753N3.1在膀胱癌細(xì)胞中的基因調(diào)控作用,有助于揭示RP13-753N3.1與膀胱癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本、細(xì)胞株及主要試劑

收集武漢大學(xué)人民醫(yī)院鄂州醫(yī)院泌尿外科膀胱癌組織和癌旁組織各16例。膀胱癌所有組織標(biāo)本經(jīng)病理科專家確定。所有患者術(shù)前均未進(jìn)行放療和化療,本研究經(jīng)過武漢大學(xué)人民醫(yī)院鄂州醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患者及家屬均簽署知情同意。陰性對(duì)照質(zhì)粒和RP13-753N3.1質(zhì)粒購自廣州銳博生物科技有限公司;人正常膀胱上皮細(xì)胞(SV-HUC-1)和膀胱癌細(xì)胞株(5637、T24、BIU-87和J82)購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。qPCR試劑盒購于日本TaKaRa公司;DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司;LipofectamineTM3000和Matrige基質(zhì)膠購自美國Invitrogen公司;qPCR引物購自上海生物工程股份有限公司;GAPDH、CDKN1A、E-cadherin、N-cadherin、Snail和Slug蛋白抗體購自英國Abcam公司(蛋白編號(hào)分別為ab8245、ab36839、ab76055、ab18203、ab53519和ab27568)。四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑盒購自美國Sigma公司。Transwell小室購自美國corning公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

膀胱癌細(xì)胞株(5637、T24、BIU-87和J82)采用10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng),人正常膀胱上皮細(xì)胞(SV-HUC-1)采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2。以對(duì)數(shù)生長期的J82細(xì)胞為轉(zhuǎn)染對(duì)象,依據(jù)LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染手冊進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒)和RP13-753N3.1組(轉(zhuǎn)染RP13-753N3.1質(zhì)粒)。轉(zhuǎn)染后第48小時(shí)檢測轉(zhuǎn)染效率并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 qPCR檢測組織或細(xì)胞中RP13-753N3.1和CDKN1A mRNA的表達(dá)

根據(jù)Trizol說明書提取組織或細(xì)胞總RNA,將吸光度在1.8-2.0的RNA樣品逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,以GAPDH為內(nèi)參,qPCR檢測組織或細(xì)胞中RP13-753N3.1和CDKN1A mRNA的表達(dá)。反應(yīng)體系為25 μl,反應(yīng)條件為96 ℃ 5 min、96 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s、70 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。Ct值采用2-ΔΔCt分析方法進(jìn)行處理,觀察組織或細(xì)胞中RP13-753N3.1和CDKN1A mRNA的表達(dá)差異。PCR引物見表1。

表1檢測RP13-753N3.1和CDKN1AmRNA表達(dá)的qPCR引物序列

Table1TheqPCRprimersequencesfordetectingRP13-753N3.1andCDKN1AmRNAexpression

基因 Sequences(5′-3′) RP13-753N3.1上游:GAACCCAAGAGATCGGGATT下游:GTTGTTGTTAAGAGACAGGGTCACCDKN1A上游:CGATGGAACTTCGACTTTGTCA下游:GCACAAGGGTACAAGACAGTGGAPDH上游:CTGTGGGAGCGAATCGAGG下游:CAGCGCAAGATGTCCATCA

1.4 免疫組化檢測膀胱癌組織中CDKN1A蛋白的表達(dá)

將膀胱癌組織和癌旁組織石蠟切片處理。脫蠟、水化后,采用0.3%過氧化氫孵育10 min。在PBS溶液中浸泡10 min,用血清工作液在室溫孵育15 min。采用一抗稀釋液(1 ∶100稀釋)在4 ℃冰箱內(nèi)過夜。在37 ℃下復(fù)溫50 min后,用PBS溶液洗2次。加入二抗在室溫下靜置50 min。用PBS溶液洗2次后,DAB顯色3 min,蘇木精復(fù)染后,用鹽酸乙醇分化,封片及鏡檢。觀察膀胱癌組織和癌旁組織中CDKN1A蛋白的表達(dá)。CDKN1A蛋白陽性反應(yīng)為棕色顆粒,以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕色顆粒作為陽性表達(dá)。

1.5 Western blotting檢測各組細(xì)胞CDKN1A及下游蛋白的表達(dá)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后第48小時(shí),收集兩組細(xì)胞并提取蛋白,應(yīng)用BCA法測兩組蛋白樣品濃度,以30 μg上樣量計(jì)算兩組上樣體積,采用聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE電泳)并硝酸纖維膜轉(zhuǎn)膜后,室溫下采用5%脫脂牛奶封閉,分別與一抗CDK4(1 ∶1 000稀釋)、CDK6(1 ∶1 000稀釋)、Slug(1 ∶500稀釋)和E-cadherin(1 ∶500稀釋)在4 ℃搖床孵育過夜,與二抗在室溫?fù)u床孵育1.5 h,采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑發(fā)光顯影,比較兩組蛋白表達(dá)差異。

1.6 MTT法檢測兩組細(xì)胞增殖能力

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后第48小時(shí),制備細(xì)胞懸液并調(diào)整密度,按5×103個(gè)/孔接種到96孔板,每孔約150 μl,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。分別于第1,2,3,4,5天加入15 μl/孔MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)3 h后,棄上清,加入200 μl/孔二甲基亞砜,搖床振蕩20 min使結(jié)晶溶解。酶標(biāo)儀測定波長在450 nm處每孔的吸光度值。

1.7 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測兩組細(xì)胞侵襲能力

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后第48小時(shí),制備細(xì)胞懸液并采用無血清培養(yǎng)基調(diào)整密度,無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞密度調(diào)整為1.5×105個(gè)/ml。將Matrige膠與無血清培養(yǎng)基按照1 ∶6稀釋,將稀釋后的Matrigel膠按照60 μl(0.2 μg/μl)加入Transwell小室,在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)20 min,保證Matrigel膠凝固。將200 μl細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室,下室加入500 μl完全培養(yǎng)基,放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。采用甲醛固定20 min,0.1%結(jié)晶紫染液染色20 min,棉簽擦去上室面細(xì)胞。顯微鏡下觀察、拍照、計(jì)數(shù)(4個(gè)高倍視野下穿過上室面的細(xì)胞數(shù)取平均值)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間分析采用t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌組織和癌旁組織中RP13-753N3.1的表達(dá)水平

與癌旁組織相比,膀胱癌組織中RP13-753N3.1低表達(dá)(P<0.01,見圖1)。

2.2 人正常膀胱上皮細(xì)胞和膀胱癌細(xì)胞株RP13-753N3.1的表達(dá)水平

與人正常膀胱上皮細(xì)胞(SV-HUC-1)相比,膀胱癌細(xì)胞株(5637、T24、BIU-87和J82)中RP13-753N3.1均呈現(xiàn)低表達(dá)(P<0.05),J82細(xì)胞中RP13-753N3.1表達(dá)水平最低(P<0.01,見圖2)。

2.3 CDKN1A在膀胱癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

采用免疫組化法檢測膀胱癌組織和癌旁組織中CDKN1A的表達(dá),CDKN1A陽性結(jié)果表現(xiàn)為細(xì)胞核棕黃色顆粒(見圖3),以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕色顆粒作為陽性表達(dá)。與癌旁組織相比,CDKN1A在膀胱癌組織中的表達(dá)明顯減少。

圖1 膀胱癌組織和癌旁組織中RP13-753N3.1的表達(dá)水平Figure 1 Expression level of RP13-753N3.1 in bladder cancer tissues and adjacent tissues

與SV-HUC-1細(xì)胞相比,*P<0.05,**P<0.01圖2 人正常膀胱上皮細(xì)胞和膀胱癌細(xì)胞株中RP13-753N3.1的表達(dá)水平Figure 2 RP13-753N3.1 expression in human normal bladder epithelial cells and bladder cancer cell lines

2.4 檢測RP13-753N3.1的轉(zhuǎn)染效率及兩組細(xì)胞中CDKN1A mRNA的表達(dá)

陰性對(duì)照組和RP13-753N3.1組J82細(xì)胞中RP13-753N3.1相對(duì)表達(dá)量分別為1.01± 0.06和15.21± 1.79(t=7.95,P<0.01)。陰性對(duì)照組和RP13-753N3.1組J82細(xì)胞中CDKN1A mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.01± 0.07和6.51± 0.98(t=5.60,P<0.01,見圖4)。與陰性對(duì)照組相比,RP13-753N3.1組細(xì)胞中CDKN1A mRNA的表達(dá)明顯下降。

2.5 過表達(dá)RP13-753N3.1對(duì)CDKN1A蛋白及下游蛋白表達(dá)的影響

Western blotting結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染RP13-753N3.1后,CDK4、CDK6和Slug蛋白的表達(dá)水平明顯降低,E-cadherin蛋白表達(dá)明顯增加(見圖5)。

圖3 膀胱癌組織和癌旁組織中CDKN1A蛋白的表達(dá)Figure 3 Expression of CDKN1A protein in bladder cancer tissues and adjacent tissues

與陰性對(duì)照組相比,**P<0.01圖4 qPCR檢測RP13-753N3.1對(duì)CDKN1A mRNA表達(dá)的影響Figure 4 The effect of RP13-753N3.1 on CDKN1A mRNA expression detected by qPCR

圖5 Western blotting檢測RP13-753N3.1對(duì)CDKN1A及下游蛋白表達(dá)的影響Figure 5 Effect of RP13-753N3.1 on the CDKN1A protein and downstream target protein expression detected by Western blotting

2.6 過表達(dá)RP13-753N3.1對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響

MTT檢測結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照組相比,RP13-753N3.1組的細(xì)胞從4 d開始,增殖能力明顯降低(P<0.05,見圖6)。

與陰性對(duì)照組相比,*P<0.05,**P<0.01圖6 RP13-753N3.1對(duì)膀胱癌細(xì)胞J82增殖能力的影響Figure 6 Effect of RP13-753N3.1 on proliferation of bladder cancer cells J82

2.7 過表達(dá)RP13-753N3.1對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響

陰性對(duì)照組和RP13-753N3.1組J82細(xì)胞侵襲細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為176.80± 12.78和98.28± 14.70(P<0.01,見圖7)。與陰性對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染RP13-753N3.1后的膀胱癌細(xì)胞侵襲能力明顯被抑制。

3 討論

近期研究表明,膀胱癌組織中存在眾多異常表達(dá)的長鏈非編碼RNA(lncRNA),參與調(diào)控膀胱癌細(xì)胞的一系列生物功能[6-9]。如LncRNA SPRY4-IT1在膀胱癌組織和細(xì)胞株中呈高表達(dá),可通過富集miR-101-3p促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和增殖,且RP13-753N3.1的表達(dá)與膀胱癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)[10]。UCA1可通過調(diào)控miR-143/HMGB1信號(hào)通路,促進(jìn)膀胱癌的侵襲和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[11]。lncRNA CASC2在膀胱癌中表達(dá)明顯降低,可通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活化,顯著降低膀胱癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力[12]。RP13-753N3.1是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA,其在疾病特別是膀胱癌中的作用尚未明確。

與陰性對(duì)照組相比,**P<0.01圖7 RP13-753N3.1對(duì)膀胱癌細(xì)胞J82侵襲能力的影響Figure 7 Effect of RP13-753N3.1 on invasion of breast cancer cells J82

本研究結(jié)果顯示,膀胱癌組織和膀胱癌細(xì)胞株中RP13-753N3.1表達(dá)顯著降低,表明RP13-753N3.1可能參與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展,其過表達(dá)對(duì)膀胱癌細(xì)胞的生物學(xué)行為可能具有抑制作用。CDKN1A全稱細(xì)胞周期依賴性激酶抑制劑1A,作為一種抑癌基因,CDKN1A在胃癌、前列腺癌等多種腫瘤中均呈現(xiàn)低表達(dá)[13-15]。有研究表明,CDKN1A在膀胱癌中表達(dá)降低,可顯著抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[16]。本研究通過免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),膀胱癌組織中CDKN1A蛋白的表達(dá)明顯減少。過表達(dá)RP13-753N3.1的J82細(xì)胞中CDKN1A表達(dá)明顯升高,說明RP13-753N3.1表達(dá)增加能上調(diào)CDKN1A表達(dá)。CDK4和CDK6是細(xì)胞周期相關(guān)蛋白,其表達(dá)增加是細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)的重要標(biāo)志[17]。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化又稱EMT,是腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲的主要分子機(jī)制,其中Slug蛋白是細(xì)胞的間質(zhì)表型,E-cadherin蛋白是上皮表型,細(xì)胞在發(fā)生EMT過程會(huì)伴隨上皮表型的丟失和間質(zhì)表型的獲得[18,19]。本研究結(jié)果表明,RP13-753N3.1誘導(dǎo)CDKN1A高表達(dá)后,CDK4、CDK6和Slug蛋白的表達(dá)明顯降低,E-cadherin蛋白的表達(dá)明顯增加,提示膀胱癌J82細(xì)胞的增殖和侵襲能力可能下降。MTT法和Transwell實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明,RP13-753N3.1的過表達(dá)可引起膀胱癌細(xì)胞的增殖能力和侵襲能力均明顯降低。RP13-753N3.1如何調(diào)控CDKN1A基因的表達(dá)尚不明確,這也是本研究下一步研究的重點(diǎn)。

綜上所述,RP13-753N3.1在膀胱癌中作為一種抑癌基因的形式存在,能明顯抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖和侵襲,其分子機(jī)制可能是通過促進(jìn)CDKN1A的表達(dá)發(fā)揮作用。本研究為進(jìn)一步研究RP13-753N3.1具體機(jī)制提供了理論基礎(chǔ),RP13-753N3.1有望成為膀胱癌診治的潛在靶點(diǎn)。