大黃素對(duì)高脂飲食小鼠腎皮質(zhì)氧化應(yīng)激的影響

張 麗,孫 耀,2*,劉寶華,李 江,劉魯漢,于亞麗

(1南京泰康仙林鼓樓醫(yī)院藥劑科,南京 210000;2錦州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院;3葫蘆島市第二人民醫(yī)院內(nèi)分泌科;4浙江省中醫(yī)院藥劑科;5錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科;*通訊作者,E-mail:15261794028@163.com)

近年來,肥胖的發(fā)病率逐年升高[1,2]。肥胖的人體和小鼠存在腎臟損傷,甚至可發(fā)展為終末期腎病,其發(fā)病機(jī)制目前還不十分清楚[3]。在無癥狀肥胖患者或動(dòng)物身上,可以觀察到腎小球腫大,腎小球硬化,足突細(xì)胞肥大,足突消失[3]和Ⅳ型膠原沉積[4]。氧化應(yīng)激損傷是糖尿病腎病病理生理過程中的一種形式。肥胖可以導(dǎo)致糖尿病,但是肥胖過程中,腎臟皮質(zhì)是否受到氧化應(yīng)激損傷,目前尚未見報(bào)道。

活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)是誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的主要物質(zhì)之一,可以攻擊生物膜而生成超氧化物,如丙二醛(malondialdehyde,MDA)等。總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)可清除超氧化物,對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用[5]。因此,檢測(cè)各組小鼠腎皮質(zhì)中、MDA和SOD可以反映組織中氧化應(yīng)激狀態(tài)。

大黃素是從大黃等中草藥根和莖中提取的一種具有生物活性的蒽醌,其具有抗菌、抗炎、抗?jié)儭⒖鼓[瘤、調(diào)節(jié)免疫力和抗糖尿病作用[6,7]。經(jīng)研究,大黃素對(duì)糖尿病腎病具有一定的治療作用[8]。本課題組之前的研究結(jié)果證明,大黃素對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠腎損傷具有一定的保護(hù)作用[9],但是大黃素是否可以改善肥胖小鼠腎皮質(zhì)氧化應(yīng)激損傷還不十分清楚。

PPAR-γ是糖尿病和肥胖中針對(duì)胰島素抵抗治療的靶點(diǎn)之一[10],吡格列酮是PPAR-γ的一種特異性激動(dòng)劑,可以改善小鼠的胰島素抵抗[11]。在之前的研究中,我們發(fā)現(xiàn),大黃素可能通過改善肥胖小鼠腎臟局部的胰島素抵抗對(duì)肥胖相關(guān)性腎病具有一定的保護(hù)作用[9]。有學(xué)者研究也認(rèn)為大黃素可以通過PPAR-γ改善糖尿病小鼠的糖代謝[12-14]。本研究利用吡格列酮作為陽性對(duì)照,擬探究大黃酸是否也可上調(diào)PPAR-γ,并改善高脂飲食小鼠腎皮質(zhì)的氧化應(yīng)激。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

大黃素(北京清源保生物科技有限公司),BCA定量試劑盒(萬類生物科技有限公司),兔抗鼠PPAR-γ多克隆抗體(萬類生物科技有限公司),β-actin多克隆抗體(Absci,美國),辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗(Absci,美國)和ECL發(fā)光試劑盒(萬類生物科技有限公司)。ROS檢測(cè)試劑盒(萬類生物科技有限公司),MDA測(cè)定試劑盒(萬類生物科技有限公司),SOD測(cè)試盒(萬類生物科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組處理

7周齡雄性C57BL/6J小鼠56只,購買自北京華阜康生物可以有限公司,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,隨機(jī)分為5組:普通飲食組(NC,n=8)、高脂飲食組(HFD,n=12)、低劑量大黃素處理組(L-EM,n=12)、高劑量大黃素處理組(H-EM,n=12)和吡格列酮對(duì)照組(PI,n=12)。NC組給予普通飲食和生理鹽水灌胃,HFD組給予高脂飲食(含60%脂肪,20%碳水化合物,20%蛋白質(zhì))和生理鹽水灌胃,L-EM組和H-EM組給予高脂飲食和大黃素灌胃[30 mg/(kg·d)]和50 mg/(kg·d),PI組給予普通飲食和吡格列酮[(1.95 mg/(kg·d)]灌胃。適應(yīng)性喂養(yǎng)后,各組小鼠特定飲食貫穿整個(gè)實(shí)驗(yàn),灌胃在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前6周開始實(shí)施至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。灌胃期間每周檢測(cè)血糖1次。空腹血糖大于11.1 mmol/L者剔除。不同飲食喂養(yǎng)12周后(20周齡)及灌胃6周后(26周齡)分別稱小鼠體質(zhì)量,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,從HFD組、L-EM、H-EM組和PI組隨機(jī)選取8只用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 生化指標(biāo)測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后斷頭取血,新鮮血離心(3 600 r/min,4 ℃)后,檢測(cè)各組小鼠空腹血糖、空腹胰島素,血肌酐、血尿素氮,并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)。提尾法搜集小鼠24 h尿液,估算24 h尿蛋白排泄率。血清標(biāo)本生化指標(biāo)為樣本經(jīng)生理鹽水稀釋3倍,尿標(biāo)本稀釋經(jīng)生理鹽水稀釋4倍,經(jīng)檢驗(yàn)科中心試驗(yàn)室由全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè),然后根據(jù)稀釋倍數(shù)換算。

1.4 Western blotting檢測(cè)腎皮質(zhì)PPAR-γ

腎皮質(zhì)組織蛋白利用RIPA提取,經(jīng)據(jù)BCA蛋白定量試劑盒定量后,調(diào)整各組蛋白濃度至3 mg/ml。聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白分離后至PVDF膜,PPAR-γ多克隆一抗(1 ∶800)4 ℃孵育過夜,過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育2 h(常溫),ECL試劑盒顯影后,Image J軟件分析條帶灰度值,量化后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定

腎皮質(zhì)以磷酸鹽緩沖液介質(zhì)勻漿后離心取上清,根據(jù)ROS檢測(cè)試劑盒、MDA測(cè)定試劑盒和SOD檢測(cè)試盒說明書指示,測(cè)定各組小鼠腎皮質(zhì)ROS、MDA和SOD含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,單因素方差分析進(jìn)行多組間比較,若存在組間差異,采用LSD法作兩兩比較,P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大黃素對(duì)各組小鼠體質(zhì)量的影響

經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后(8周齡),各組小鼠體質(zhì)量之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)普通飲食或高脂飲食喂養(yǎng)12周后(20周齡),與NC組小鼠相比,HFD組、L-EM組、H-EM組和PI組小鼠體質(zhì)量明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且HFD組、L-EM組、H-EM組和PI組小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)生理鹽水、大黃素或吡格列酮灌胃6周后(26周齡),與NC組相比,HFD組小鼠體質(zhì)量明顯增加,與HFD組相比,L-EM組、H-EM組和PI組小鼠體質(zhì)量降低,且與L-EM組相比,H-EM小鼠體質(zhì)量更低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表1)。

表1不同時(shí)期各組小鼠體質(zhì)量的比較(g)

Table1Comparisonofbodyweightsofmiceatdifferenttimepointsbetweenfivegroups(g)

組別8周齡 20周齡 26周齡 NC組24.14±0.7430.79±1.8432.05±1.49HFD組23.96±0.9938.88±2.00?42.97±1.89?L-EM組23.97±1.0038.83±1.99?40.66±1.60?#H-EM組24.00±0.9338.65±2.24?38.77±1.44?#&PI組24.01±0.6738.65±2.08?39.84±1.58?#

與NC組相比,*P<0.05;與HFD組相比,#P<0.05;與L-EM組相比,&P<0.05

2.2 大黃素對(duì)小鼠空腹血糖、空腹胰島素、胰島素敏感指數(shù)的影響

與NC組相比,HFD組小鼠空腹血糖、空腹胰島素水平增加,胰島素敏感指數(shù)降低;與HFD組相比,L-EM組、H-EM組和PI組小鼠空腹血糖、空腹胰島素水平降低,胰島素敏感指數(shù)增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但L-EM組與HFD組相比,小鼠空腹血糖和胰島素敏感指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與L-EM組相比,H-EM組空腹胰島素水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖1)。

與NC組相比,*P<0.05;與HFD組相比,#P<0.05;與L-EM組相比,&P<0.05圖1 各組小鼠空腹血糖,空腹胰島素和胰島素敏感指數(shù)的比較Figure 1 Comparison of fasting plasma, fasting serum insulin and insulin sensitivity index between five groups

2.3 大黃素對(duì)小鼠血肌酐、血尿素氮、24 h尿蛋白排泄率的影響

各組小鼠血肌酐水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與NC組小鼠相比,HFD組小鼠24 h尿蛋白排泄率明顯增加;與HFD組相比,L-EM組和H-EM組小鼠血尿素氮水平降低,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與HFD組相比,L-EM組、H-EM組和PI組小鼠24 h尿蛋白排泄率明顯減少,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與L-EM組,H-EM組小鼠24 h尿蛋白排泄率減少,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖2)。

2.4 大黃素對(duì)小鼠腎皮質(zhì)氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

與NC組相比,HFD組小鼠腎皮質(zhì)ROS和MDA含量增加,SOD活力下降,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與HFD組相比,L-EM組、H-EM組和PI組小鼠腎皮質(zhì)ROS和MDA含量減少,SOD活力增加。但HFD組和L-EM組ROS含量和SOD活力間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,HFD組和PI組SOD活力間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與L-EM組相比,H-EM組小鼠腎皮質(zhì)ROS和MDA含量減少,SOD活力增加,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖3)。

與NC組相比,*P<0.05;與HFD組相比,#P<0.05圖2 各組小鼠血肌酐、血尿素氮、尿蛋白排泄率的比較Figure 2 Comparison of serum creatinine, blood urea nitrogen, and urine creatinine between five groups

與NC組相比,*P<0.05;與HFD組相比,#P<0.05圖3 各組小鼠ROS、MDA含量和SOD活力的比較Figure 3 Comparison of ROS, MDA levels and SOD activity between five groups

2.5 大黃素對(duì)小鼠腎皮質(zhì)PPAR-γ的影響

與NC組相比,HFD組小鼠腎皮質(zhì)PPAR-γ表達(dá)量減少(P<0.05);與HFD組相比,L-EM組、H-EM組和PI組小鼠腎皮質(zhì)PPAR-γ表達(dá)量增加,但與HFD組相比,L-EM組小鼠腎皮質(zhì)PPAR-γ表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與L-EM組相比,H-EM組小鼠腎皮質(zhì)具有更高的PPAR-γ表達(dá)量,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖4)。

與NC組相比,*P<0.05;與HFD組相比,#P<0.05;與L-EM組相比,&P<0.05圖4 各組小鼠腎皮質(zhì)PPAR-γ表達(dá)量的比較Figure 4 Comparison of PPAR-γ levels in kidney of mice between five groups

3 討論

肥胖相關(guān)性腎病在近年來引起了越來越多研究者的關(guān)注[3],但是其發(fā)病機(jī)制尚不十分明確。為了探究肥胖相關(guān)性腎病早期存在的變化,本研究利用高脂飲食誘導(dǎo)了肥胖小鼠,結(jié)果與正常小鼠相比,肥胖小鼠血肌酐和尿素氮水平無明顯變化,但是24 h尿蛋白排泄率略有增加。為了進(jìn)一步探究大黃素對(duì)肥胖相關(guān)性腎病的保護(hù)作用,本研究利用不同濃度的大黃素治療高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠,結(jié)果顯示,大黃素可以降低高脂飲食誘導(dǎo)小鼠的血尿素氮和24 h尿蛋白排泄率。

氧化應(yīng)激損傷是糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展過程中的重要機(jī)制之一[6]。肥胖可以導(dǎo)致糖尿病,腎皮質(zhì)是腎小球主要分布的區(qū)域,但是在肥胖相關(guān)性腎病中,肥胖小鼠的腎皮質(zhì)是否存在氧化應(yīng)激損傷還不十分清楚。如前言所述,ROS、MDA和SOD可反映組織的氧化應(yīng)激狀態(tài)[6]。為了探究肥胖相關(guān)性腎病小鼠腎皮質(zhì)是否存在氧化應(yīng)激損傷,本研究檢測(cè)了各組小鼠腎皮質(zhì)的ROS和MDA含量和SOD活力,結(jié)果顯示,大黃素可以降低高脂飲食小鼠腎皮質(zhì)的氧化應(yīng)激損傷水平。

在之前的研究中[9],大黃素可以通過改善腎皮質(zhì)的胰島素抵抗而對(duì)肥胖相關(guān)性腎病具有一定的保護(hù)作用。吡格列酮是一種經(jīng)典的PPAR-γ激動(dòng)劑,可以改善胰島素抵抗。為了進(jìn)一步探究大黃素改善肥胖小鼠腎皮質(zhì)氧化應(yīng)激的機(jī)制,本研究設(shè)置了吡格列酮對(duì)照組,發(fā)現(xiàn)吡格列酮和大黃素都可以降低肥胖小鼠24 h尿蛋白排泄率血尿素氮。

為了進(jìn)一步探究大黃素是否通過PPAR-γ改善各組小鼠腎皮質(zhì)的氧化應(yīng)激損傷,本研究檢測(cè)了各組小鼠腎皮質(zhì)的PPAR-γ表達(dá)量,結(jié)果發(fā)現(xiàn),肥胖小鼠腎皮質(zhì)PPAR-γ表達(dá)減少,大黃素和吡格列酮處理后,PPAR-γ表達(dá)量增加。也就是說,大黃素可能通過PPAR-γ改善了肥胖小鼠腎皮質(zhì)的氧化應(yīng)激水平,但是其結(jié)論的準(zhǔn)確性仍需要通過利用基因修飾的小鼠和(或)PPAR-γ特異性激動(dòng)劑和(或)特異性阻斷劑作進(jìn)一步研究。

致謝:

遼寧省自然科學(xué)基金(201602308)提供了部分的科研資金,錦州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室為本實(shí)驗(yàn)提供了實(shí)驗(yàn)設(shè)備。