瑞舒伐他汀、依折麥布對ox-LDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞LXRα、ABCA1及Caveolin-1 mRNA表達(dá)的影響

王玉玲,員旭紅,賀彧彬,李 佳,韓永魁,申曉彧*

(1山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院心內(nèi)科,太原 030001;2山西省心血管病醫(yī)院心內(nèi)科;3太原市中心醫(yī)院心內(nèi)科;*通訊作者,E-mail:shenxy65@sina.com)

膽固醇逆轉(zhuǎn)運(reverse cholesterol transport,RCT)包括肝外組織細(xì)胞中膽固醇的外流、膽固醇的酯化及膽固醇酯的清除,是調(diào)控膽固醇代謝的主要機制,對維持體內(nèi)膽固醇的平衡具有重要意義[1,2]。LXRα是配體依賴性的核受體超家族成員,ABCA1作為LXRα的直接靶基因之一,通過編碼膜整合蛋白,促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出,減少細(xì)胞內(nèi)膽固醇蓄積,是調(diào)控RCT的始動環(huán)節(jié)[3,4]。ABCA1的結(jié)構(gòu)及其介導(dǎo)膽固醇流出的大部分機制尚不明確。小凹(Caveolae)是膽固醇流出的主要通道,當(dāng)細(xì)胞內(nèi)膽固醇濃度增高時,大部分Caveolin-1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體與Caveolae之間往返穿梭,將細(xì)胞內(nèi)的膽固醇轉(zhuǎn)移至胞膜Caveolae區(qū)域,進(jìn)而參與膽固醇的外流[5]。他汀類藥物及依折麥布分別通過加強血清膽固醇清除及抑制小腸內(nèi)膽固醇的吸收,達(dá)到抗動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)的作用[6,7]。但瑞舒伐他汀及依折麥布是否通過增加LXRα、ABCA1及Caveolin-1的表達(dá),促進(jìn)膽固醇的外流作用尚不明確,本研究探討瑞舒伐他汀、依折麥布及兩者聯(lián)合對ox-LDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞LXRα、ABCA1及Caveolin-1 mRNA表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑

原代大鼠胸主動脈VSMCs細(xì)胞購自江陰齊氏生物科技有限公司;DMEM/F12培養(yǎng)液、油紅O染液購自武漢博士德生物工程有限公司;ox-LDL購自北京協(xié)生生物科技有限責(zé)任公司;RNA提取試劑盒、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Takara大連生物工程公司;PCR引物及熒光定量PCR試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司;依折麥布為杭州默沙東制藥有限公司饋贈,瑞舒伐他汀購自浙江京新藥業(yè)股份有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

用含15% FBS及1%青鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)大鼠胸主動脈VSMCs,3-5 d傳1代,采用3-5代細(xì)胞進(jìn)行實驗研究。

1.3 泡沫細(xì)胞模型的建立

在VSMCs中加入50 μg/ml的ox-LDL進(jìn)行干預(yù)48 h,采用油紅O染液染色法鑒定,倒置顯微鏡觀察細(xì)胞泡沫化的情況以明確泡沫細(xì)胞的建立。

1.4 實驗分組

實驗分為9組:組1為空白對照組,不干預(yù),僅單獨培養(yǎng)VSMCs 48 h;組2為泡沫細(xì)胞組,用ox-LDL 50 μg/ml誘導(dǎo)VSMCs,培養(yǎng)48 h;組3-5為瑞舒伐他汀組,在組2基礎(chǔ)上,分別加入瑞舒伐他汀0.1,1.0,5.0 μmol/L,培養(yǎng)24 h;組6-8為依折麥布組,在組2基礎(chǔ)上,分別加入依折麥布3.0,10.0,30.0 μmol/L,培養(yǎng)24 h;組9為最適濃度聯(lián)合組,在組2基礎(chǔ)上,加入瑞舒伐他汀5.0 μmol/L和依折麥布30.0 μmol/L,培養(yǎng)24 h。

1.5 用PCR檢測各組中LXRα,ABCA1及Caveolin-1 mRNA表達(dá)水平

使用Trizol試劑盒一步法提取總RNA,利用超微量分光光度儀Nano Drop測定各組樣品RNA的濃度及吸光度值。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime Script RT reagent Kit)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ?qū)⒛孓D(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴增。LXRα上游引物序列:5′-TTCTCAATCATGCCCAGTTG-3′,下游引物序列:5′-AAGCGTCAAGAAGAGGAGCA-3′。ABCA1上游引物序列:5′-AATGGTCAATGGGAGGTTCA-3′,下游引物序列:5′-TGGACAGGCTTTAGGTCAGG-3′。Caveolin-1上游引物序列:5′-GAGCGAGAAGCAAGTGTACGA-3′,下游引物序列:5′-ACAGACGGTGTGGAACGTAGAT-3′。RT-PCR反應(yīng)結(jié)果獲得Ct值。mRNA表達(dá)相對量用2-ΔΔCt表示。

1.6 酶熒光化學(xué)法檢測細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量

將各組干預(yù)后的細(xì)胞,加入500 μl正己烷/異丙醇(3 ∶2)混合液,使用超聲粉碎儀粉碎(3 min),離心(800 r/min,15 min),并取上清液,在發(fā)射波長為590 nm處檢測熒光值,參考Lab Assay TM-Cholesterol膽固醇定量檢測試劑盒說明書,測定FC、TC和CE的含量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 平滑肌細(xì)胞和泡沫細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

低倍鏡下觀察可看到正常的平滑肌細(xì)胞為梭形或長梭形。高倍鏡下觀察到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有大量的纖維細(xì)絲,和細(xì)胞的長軸平行,細(xì)胞核呈卵圓形,位置居中。ox-LDL干預(yù)后,用油紅O染色,泡沫細(xì)胞形態(tài)飽滿,細(xì)胞內(nèi)可見大量紅色脂滴顆粒,確定泡沫細(xì)胞建立成功。

2.2 瑞舒伐他汀、依折麥布單藥對LXRα、ABCA1及Caveolin-1 mRNA表達(dá)的影響

與空白對照組比較,泡沫細(xì)胞組LXRα、ABCA1及Caveolin-1 mRNA表達(dá)減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與泡沫細(xì)胞組比較,不同劑量瑞舒伐他汀干預(yù)后,各組LXRα、ABCA1及Caveolin-1 mRNA表達(dá)均上調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),且呈一定的劑量依賴趨勢(見圖1);不同劑量依折麥布干預(yù)后,各組LXRα、ABCA1及Caveolin-1 mRNA表達(dá)均上調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),且呈一定的劑量依賴趨勢(見圖2)。

與組1比較,aP<0.05;與組2比較,bP<0.05;與組3比較,cP<0.05;與組4比較,dP<0.05組1-5分別為空白對照組,泡沫細(xì)胞組,不同濃度瑞舒伐他汀單藥組(0.1,1.0,5.0μmol/L)圖1 瑞舒伐他汀對LXRα、ABCA1及Caveolin-1 mRNA表達(dá)的影響Figure 1 Effect of rosuvastatin on expression levels of LXR α, ABCA1 and caveolin-1 mRNA

與組1比較,aP<0.05;與組2比較,bP<0.05;與組6比較,cP<0.05;與組7比較,dP<0.05組1為空白對照組;組2為泡沫細(xì)胞組;6-組8分別為不同濃度依折麥布單藥組(3.0,10.0,30.0 μmol/L)圖2 依折麥布對LXRα、ABCA1及Caveolin-1 mRNA表達(dá)的影響Figure 2 Effect of ezetimibe on expression of LXR α, ABCA1 and caveolin-1 mRNA

2.3 瑞舒伐他汀聯(lián)合依折麥布對LXRα、ABCA1及Caveolin-1 mRNA表達(dá)的影響

最適濃度的瑞舒伐他汀及依折麥布的聯(lián)合組與分別對應(yīng)濃度的單藥組相比,LXRα、ABCA1及Caveolin-1 mRNA表達(dá)增加更為顯著,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖3)。

2.4 瑞舒伐他汀聯(lián)合依折麥布對膽固醇含量的影響

與空白對照組相比,泡沫細(xì)胞組TC、FC、CE含量明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與泡沫細(xì)胞組相比,瑞舒伐他汀、依折麥布單藥組TC、FC、CE含量均減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);且與單藥組相比,聯(lián)合組TC、FC、CE含量減少更顯著,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖4)。

與組1比較,aP<0.05;與組2比較,bP<0.05;與組5比較,cP<0.05;與組8比較,dP<0.05組1為空白對照組;組2為泡沫細(xì)胞組;組5為5.0 μmol/L瑞舒伐他汀組;組8為30.0 μmol/L依折麥布組;組9為最適濃度聯(lián)合組圖3 瑞舒伐他汀聯(lián)合依折麥布對LXRα、ABCA1及Caveolin-1 mRNA表達(dá)的影響Figure 3 Effect of rosuvastatin combined with ezetimibe on expression levels of LXRα,ABCA1 and Caveolin-1 mRNA

與組1比較,aP<0.05;與組2比較,bP<0.05;與組5比較,cP<0.05;與組8比較,dP<0.05組1為空白對照組;組2為泡沫細(xì)胞組;組5為5.0 μmol/L瑞舒伐他汀組;組8為30.0 μmol/L依折麥布組;組9為最適濃度聯(lián)合組圖4 瑞舒伐他汀聯(lián)合依折麥布對膽固醇含量的影響Figure 4 Effect of rosuvastatin combined with ezetimibe on cholesterol levels

3 討論

LXRα及Caveolin-1參與了細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出,并起重要作用。LXRα與特定配體結(jié)合后上調(diào)編碼ABCA1基因,增強ABCA1蛋白的表達(dá),促進(jìn)游離膽固醇流出,進(jìn)而降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量[4]。Caveolin-1具有結(jié)合和轉(zhuǎn)載膽固醇的功能,促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇外流[5]。Chan-YenKuo等[8]研究證明Caveolin-1Δ62-100是一個低聚區(qū)域,也是與ABCA1相互作用共同調(diào)控膽固醇外流的附著點。Lin等[9]在大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞膽固醇外流中發(fā)現(xiàn)了Caveolin-1和ABCA1協(xié)同作用于內(nèi)皮細(xì)胞中高密度脂蛋白介導(dǎo)的膽固醇外流,且小干擾RNA對Caveolin-1的抑制降低了ABCA1的表達(dá),降低了膽固醇外流。

據(jù)研究證實,他汀類可通過LXRα進(jìn)而使ABCA1的表達(dá)增強,此作用可通過過氧化物酶體增殖劑激活受體α、γ實現(xiàn)[10]。有研究認(rèn)為,ABCA1、Caveolin-1等脂質(zhì)蓄積調(diào)控子在依折麥布發(fā)揮抗AS效應(yīng)中有重要作用[11,12]。在本次研究中,分別用不同劑量的瑞舒伐他汀及依折麥布干預(yù)泡沫細(xì)胞組后,LXRα、ABCA1及Caveolin-1 mRNA表達(dá)量均增加,且表達(dá)呈一定的劑量依賴性。說明瑞舒伐他汀和依折麥布可能通過上調(diào)LXRα、ABCA1及Caveolin-1的表達(dá),促進(jìn)膽固醇的流出,進(jìn)而延緩AS的進(jìn)展。

他汀類與依折麥布聯(lián)合降脂治療,已被臨床廣泛應(yīng)用。但是在抗動脈粥樣硬化方面研究較少,本研究將兩者結(jié)合,探討其共同抗動脈粥樣硬化的作用。本研究用最適濃度的瑞舒伐他汀和依折麥布聯(lián)合進(jìn)行干預(yù),LXRα、ABCA1及Caveolin-1 mRNA表達(dá)更加顯著,細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量減少更明顯,提示兩者可能共同通過增加LXRα、ABCA1及Caveolin-1 mRNA的表達(dá),增加膽固醇外流,調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)膽固醇的動態(tài)平衡,減少脂質(zhì)蓄積。研究表明,他汀類在起始劑量就有良好的療效,當(dāng)劑量增倍時,降脂幅度甚微,且副作用發(fā)生率高。本研究將兩種藥物聯(lián)合治療,證實比單藥組更能明顯的促進(jìn)膽固醇的外流,綜合考慮到患者的獲益和安全性,減少長期或大劑量使用他汀帶來的副作用,采用聯(lián)合依折麥布降脂治療在臨床上有一定的指導(dǎo)意義。但兩者藥物對膽固醇逆轉(zhuǎn)運的其他作用機制,尚需進(jìn)一步研究。