Ang-(1-7)和Ang Ⅱ?qū)≡葱耘菽?xì)胞高密度脂蛋白受體、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子A1表達(dá)的影響

梁長清,莊德貞,高 然,陳 軍,楊志明

(1深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院心內(nèi)科,深圳 518101;2山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心內(nèi)科;*通訊作者,E-mail:lcqt3@hotmail.com)

平滑肌源性泡沫細(xì)胞是動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)形成的重要標(biāo)志之一[1]。細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)攝取過多和/或流出減少導(dǎo)致脂質(zhì)大量蓄積是泡沫細(xì)胞形成的主要原因[2]。三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體(ATP binding cassette transporter,ABC)家族中的ABCA1主要負(fù)責(zé)膽固醇的流出[3]。ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出至胞外乏脂的載脂蛋白A1(apolipoprotein A1,ApoA1)形成新生高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)。HDL主要通過促進(jìn)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)(reverse cholesterol transport,RCT)發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。清道夫受體高密度脂蛋白受體(scavenger receptor class B type 1,SR-BI)是HDL的高親和力受體,具有特異的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能,可介導(dǎo)HDL從外周組織接受過量的膽固醇,并在HDL內(nèi)部把膽固醇轉(zhuǎn)變?yōu)槟懝檀减?經(jīng)代謝排出體外或生成激素,故SR-BI在清除體內(nèi)多余膽固醇的過程中起到重要作用[4]。

血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)是腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system,RAS)的主要活性成分之一,可逆轉(zhuǎn)巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇外流,促進(jìn)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的形成。而血管緊張素-(1-7)[angiotensin-(1-7),Ang-(1-7)]具有抗血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、抑制炎癥因子、利鈉利尿等拮抗Ang Ⅱ的作用。目前,有關(guān)Ang Ⅱ能否抑制肌源性泡沫細(xì)胞SR-BI、ABCA1的表達(dá)以及Ang-(1-7)能否拮抗Ang Ⅱ的此作用,少見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以肌源性泡沫細(xì)胞為研究對(duì)象,通過觀察Ang-(1-7)與Ang Ⅱ?qū)?xì)胞SR-BI、ABCA1表達(dá)的作用,初步探討RAS對(duì)肌源性泡沫細(xì)胞RCT的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑

小鼠平滑肌細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫,PMA、Ang Ⅱ、Ang-(1-7)、A-779、apoA-Ⅰ、油紅O試劑均購于美國Sigma公司,DEME培養(yǎng)基、胎牛血清購于美國HyClone公司,胰蛋白酶購于美國GIBCO公司,oxLDL購于北京協(xié)生生物科技有限責(zé)任公司,引物購自寶生物工程(大連)有限公司,總RNA提取試劑盒(Trizol)購自美國Promega公司,抗熒光淬滅劑、兔單克隆抗體SR-BI一抗、小鼠單克隆抗體ABCA1一抗購自美國Santa cruz公司,HRP標(biāo)記山羊抗兔、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠二抗購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞鑒定與培養(yǎng)傳代

細(xì)胞制備:實(shí)驗(yàn)前接種105個(gè)細(xì)胞到24孔板中(爬片),37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。

免疫熒光鑒定:取培養(yǎng)后細(xì)胞,PBS清洗,經(jīng)固定、透化、封閉,分別加入一抗α-actin(1 ∶50)、二抗(goat anti-rabbit-488,1 ∶100)孵育,DAPI染核,在載玻片上滴加抗熒光淬滅劑,將蓋玻片倒扣在載玻片上,滴加指甲油封片。倒置熒光顯微鏡拍照。

細(xì)胞培養(yǎng)傳代:小鼠原代VSMCs中加入含15%胎牛血清及1%青-鏈霉素溶液的DMEM/F12培養(yǎng)基,5%CO2、37 ℃培養(yǎng),隔日換液1次。當(dāng)細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶底部80%以上面積時(shí),加入1 ml含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化傳代,3-5 d傳1代。采用對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

1.3 平滑肌源性泡沫細(xì)胞模型的制備及鑒定

取3-5代細(xì)胞消化后,接種合適的細(xì)胞量到24孔板爬片,5%FBS+DMEM預(yù)先饑餓培養(yǎng)24 h,再加入終濃度為100 mg/L的oxLDL,培養(yǎng)72 h,使VSMC轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞,建立泡沫細(xì)胞模型[5]。泡沫細(xì)胞形成通過油紅O染色證明。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及處理

實(shí)驗(yàn)分為六組:①control組,即肌源性泡沫細(xì)胞組;②100 nmol/L Ang Ⅱ組;③100 nmol/L Ang-(1-7)組;④100 nmol Ang-(1-7)+100 nmol/L Ang Ⅱ組,在先加入100 nmol Ang Ⅱ 1 h后加入100 nmol Ang-(1-7);⑤100 nmol/L Ang Ⅱ+100 nmol/L Ang-(1-7)+100 nmol A-779組,先加入100 nmol/L Ang Ⅱ 1 h后再加入100 nmol/L Ang-(1-7)及100 nmol/L Ang-(1-7)特異性拮抗劑A-779;⑥100 nmol/L A-779組。細(xì)胞按以上分組,每組藥物干預(yù)48 h后離心收集細(xì)胞,-70 ℃冰箱保存待用。每組設(shè)6個(gè)復(fù)管,用于SR-BI、ABCA1蛋白及基因水平的表達(dá)的檢測(cè)。

1.5 Western-blot檢測(cè)ABCA1、SR-BI蛋白的含量

抽提細(xì)胞蛋白定量后,將樣品變性、加樣(配取5%濃縮膠與8%分離膠用于檢測(cè)ABCA1蛋白,配取10%濃縮膠與8%分離膠用于檢測(cè)SR-BI蛋白),均用SDS-PAGE垂直凝膠電泳分離不同分子量的蛋白質(zhì),電轉(zhuǎn)移于NC膜上。轉(zhuǎn)膜后封閉液封閉過夜,按1 ∶1 000分別加入小鼠單克隆抗體ABCA1一抗、兔單克隆抗體SR-BI一抗,4 ℃孵育過夜,TBST洗3次,按1 ∶5 000的稀釋倍數(shù)分別加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠二抗、羊抗兔IgG,室溫孵育2 h,TBST洗3次。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法,X片放射自顯影,數(shù)碼凝膠圖像定量分析系統(tǒng)成像、條帶密度掃描,以同管β-actin為內(nèi)參照,分別測(cè)定各樣本ABCA1、SR-BI蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 RT-PCR檢測(cè)ABCA1 mRNA、SR-BI mRNA的表達(dá)

用Trizol抽提細(xì)胞總RNA,紫外分光光度儀確定樣品中RNA純度(OD260/OD280=1.8-2.0)與含量。將RNA逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA作為模板進(jìn)行擴(kuò)增。ABCA1 PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性95 ℃,3 min;95 ℃變性10 s;60 ℃退火15 s;72 ℃延伸1 min;72 ℃終止5 min,共40個(gè)循環(huán)。SR-BI PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性95 ℃,3 min;95 ℃變性10 s;58 ℃退火15 s;72 ℃延伸20 s;72 ℃再延伸5 min;繼續(xù)擴(kuò)增至40個(gè)循環(huán)。GAPGH PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性94 ℃,4 min;94 ℃變性1 min;55 ℃退火30 s;72 ℃延伸1 min;72 ℃終止5 min,共40個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳回收,用全自動(dòng)凝膠分析系統(tǒng)灰度掃描分析。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計(jì)算各組目的產(chǎn)物的基因相對(duì)表達(dá)量(引物序列見表1)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

表1各組引物序列

Table1Primersequencesofdifferentgenes

名稱引物序列 產(chǎn)物長度(bp) ABCA1上游:5′-GGAGGCAATGGCACTGAG-3′107下游:5′-ATGCGGGAAAGAGGACTA-3′ SR-BI上游:5′-CCCATCCTCACTTCCTCAA-3′170下游:5′-GCCTGCGACAGATTTCAT-3′ GAPGH上游:5′-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3′496下游:5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′

2 結(jié)果

2.1 平滑肌細(xì)胞的形態(tài)鑒定結(jié)果

低倍鏡下觀察可看正常的平滑肌細(xì)胞為梭形或長梭形,呈典型的“峰谷”生長。高倍鏡下觀察可以看到胞質(zhì)內(nèi)有大量的纖維細(xì)絲,與細(xì)胞的長軸平行,細(xì)胞核呈卵圓形,位置居中,證明所培養(yǎng)的細(xì)胞是平滑肌細(xì)胞(見圖1)。

2.2 平滑肌細(xì)胞的免疫熒光鑒定結(jié)果

免疫熒光顯示平滑肌細(xì)胞的標(biāo)記分子SMA為陽性(見圖2),證明所分離的細(xì)胞為平滑肌細(xì)胞,純度在98%以上[6]。

A.光鏡下 (×40) B.光鏡下HE染色 (×400)圖1 正常生長的平滑肌細(xì)胞形態(tài)Figure 1 Morphology of VSMCs

圖2 平滑肌細(xì)胞的免疫熒光結(jié)果 (DAPI染色法,×400)Figure 2 SMA immunofluorescence staining of VSMCs (DAPI staining,×400)

2.3 泡沫細(xì)胞的形態(tài)及鑒定結(jié)果

ox-LDL處理VSMC后形成肌源性泡沫細(xì)胞,進(jìn)行油紅O染色,光鏡下可見平滑肌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化,呈不規(guī)則性,胞質(zhì)內(nèi)大量紅色脂滴顆粒存在,而細(xì)胞核呈淡藍(lán)色,符合泡沫細(xì)胞的形態(tài)特征(見圖3)。

A.放大倍數(shù)×100 B.放大倍數(shù)×200圖3 光鏡下油紅O染色的肌源性泡沫細(xì)胞的形態(tài)Figure 3 The shape of VSMCs derived foam cells by oil red O staining under light microscope

2.4 Ang Ⅱ與Ang-(1-7)對(duì)肌源性泡沫細(xì)胞SR-BI、ABCA1蛋白表達(dá)的影響

與control組比較,Ang-(1-7)組SR-BI、ABCA1表達(dá)明顯增加(P<0.05),而Ang Ⅱ組顯著抑制細(xì)胞表面SR-BI、ABCA1蛋白的表達(dá)(P<0.05);Ang Ⅱ+Ang-(1-7)組與Ang Ⅱ組比較,SR-BI、ABCA1蛋白的表達(dá)明顯增加(P<0.05),但與Ang-(1-7)組比較差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);Ang Ⅱ+Ang-(1-7)+A-779組與Ang-(1-7)組比較SR-BI、ABCA1的表達(dá)明顯減弱(P<0.05),但與Ang Ⅱ組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見表2,圖4)。

組別SR-BI蛋白相對(duì)表達(dá)量ABCA1蛋白相對(duì)表達(dá)量control組Ang Ⅱ組Ang-(1-7)組Ang Ⅱ+Ang-(1-7)組Ang Ⅱ+Ang-(1-7)+A-779組A-779組0.761±0.0180.452±0.021?0.992±0.026?#1.194±0.031?#0.555±0.019?0.732±0.0250.594±0.0410.431±0.020?0.626±0.037?#0.738±0.036?#0.497±0.018?0.536±0.033

與control組比較,*P<0.05;與Ang Ⅱ組比較,#P<0.05

1.control組; 2.Ang Ⅱ組;3.Ang-(1-7)組;4.Ang Ⅱ+Ang-(1-7)組;5.Ang Ⅱ+Ang-(1-7)+A-779組;6.A-779組圖4 各組肌源性泡沫細(xì)胞SR-BI、ABCA1蛋白的表達(dá)Figure 4 SR-BI,ABCA1 protein expression in VSMCs-derived foam cells after different treatments

2.5 Ang Ⅱ與Ang-(1-7)對(duì)肌源性泡沫細(xì)胞SR-BI mRNA、ABCA1 mRNA表達(dá)的影響

在肌源性泡沫細(xì)胞中,與control組比較,Ang-(1-7)組SR-BI mRNA、ABCA1 mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.05),而Ang Ⅱ組SR-BI mRNA、ABCA1 mRNA的表達(dá)顯著減弱(P<0.05);Ang Ⅱ+Ang-(1-7)組與Ang Ⅱ組比較, SR-BI mRNA、ABCA1 mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.05),但與Ang-(1-7)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);Ang Ⅱ+Ang-(1-7)+A-779組與Ang-(1-7)組比較,SR-BI mRNA、ABCA1 mRNA的表達(dá)明顯減弱(P<0.05),但與Ang Ⅱ組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見表3)。

組別SR-BI mRNA相對(duì)表達(dá)量ABCA1 mRNA相對(duì)表達(dá)量control組1.359±0.6121.354±0.753Ang Ⅱ組0.793±0.670?0.614±0.372?Ang-(1-7)組3.004±1.208?#3.911±0.294?#Ang Ⅱ+Ang-(1-7)組2.129±0.099?#1.938±0.906?#Ang Ⅱ+Ang-(1-7)+A-779組1.051±0.417?0.910±0.462?A-779組1.142±0.4041.015±0.207

與control組比較,*P<0.05;與Ang Ⅱ組比較,#P<0.05

3 討論

在AS中晚期病變中,血管平滑肌細(xì)胞結(jié)合并吞噬氧化的低密度脂蛋白,形成泡沫細(xì)胞,進(jìn)而促進(jìn)了AS發(fā)展[7]。在膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)(RCT)過程中,高密度脂蛋白將膽固醇從周圍組織(包括動(dòng)脈粥樣斑塊)轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟進(jìn)行再循環(huán)或以膽酸的形式排泄,從而減輕動(dòng)脈粥樣硬化病灶[8]。ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體和清道夫受體BI是介導(dǎo)RCT的兩個(gè)關(guān)鍵蛋白[9]。

ABCA1是細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白,將細(xì)胞內(nèi)膽固醇和磷脂(主要是卵磷脂)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面的HDL前體apoAI,該蛋白負(fù)責(zé)RCT的第一步也是主要的限速步驟[10]。近期研究表明[11],在血管平滑肌細(xì)胞中,激活TRPV1能夠通過鈣調(diào)蛋白和PKA依賴的機(jī)制增加ABCA1的表達(dá);而上調(diào)ABCA1的表達(dá)后,可促進(jìn)其介導(dǎo)的膽固醇外流,從而有效清除細(xì)胞內(nèi)蓄積的膽固醇,最終阻斷或延緩AS的發(fā)生、發(fā)展[12,13]。本研究顯示,Ang-(1-7)可促進(jìn)平滑肌源性泡沫細(xì)胞ABCA1表達(dá),與相關(guān)報(bào)道一致[14]。

SR-BI是位于細(xì)胞表面的糖蛋白,在肝臟中大量表達(dá)[15,16]。在RCT起始過程中,SR-BI結(jié)合HDL促進(jìn)膽固醇外流,防止其在外周動(dòng)脈壁的堆積;SR-BI還可以介導(dǎo)HDL膽固醇酯(CE)的選擇性吸收[17,18]。研究發(fā)現(xiàn),SR-BI基因敲除會(huì)加重apoE-/-基因敲除小鼠的AS病變,而apoE基因敲除小鼠移植SR-BI+/+小鼠骨髓后,粥樣斑塊面積明顯減小[19]。以上研究表明SR-BI在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出,維持細(xì)胞內(nèi)膽固醇平衡中起關(guān)鍵作用。本實(shí)驗(yàn)顯示,Ang Ⅱ抑制了肌源性泡沫細(xì)胞SR-BI表達(dá),而Ang-(1-7)則促進(jìn)了SR-BI的表達(dá)。

Ang Ⅱ與Ang-(1-7)均屬于RAS成員,Ang Ⅱ具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、心肌細(xì)胞肥大、間質(zhì)纖維化、水鈉潴留及動(dòng)脈粥樣硬化的作用。已有研究顯示Ang-(1-7)通過ERK1/2通路拮抗Ang Ⅱ誘導(dǎo)的平滑肌增殖及遷移[20],并可拮抗Ang Ⅱ誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞ABCA1、SR-BI表達(dá)的減少,促進(jìn)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn),進(jìn)而減少泡沫細(xì)胞的形成[21]。而在巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞形成后,Ang-(1-7)亦可拮抗Ang Ⅱ?qū)BCA1SR-BI表達(dá)的抑制作用[21]。本研究亦顯示,在肌源性泡沫細(xì)胞中Ang-(1-7)可拮抗Ang Ⅱ?qū)BCA1、SR-BI表達(dá)的抑制作用;當(dāng)加入Ang-(1-7)特異性受體MAS受體拮抗劑A-799后,Ang-(1-7)抑制Ang Ⅱ的作用完全消失,提示Ang-(1-7)通過MAS受體介導(dǎo)發(fā)揮拮抗Ang Ⅱ的作用。已有研究表明,ABCA1、SR-BI的表達(dá)水平還受PPAR、p38 MAPK/JNK等多種因素調(diào)控[22,23],但Ang-(1-7)能否通過PPAR、p38MAPK/JNK等信號(hào)途徑影響ABCA1、SR-BI表達(dá)尚需進(jìn)一步論證。因此,深入研究Ang-(1-7)與Ang Ⅱ之間的相互關(guān)系及其對(duì)泡沫細(xì)胞RCT的影響機(jī)制,將會(huì)為防治動(dòng)脈粥樣硬化提供新的靶點(diǎn)和作用途徑。