CYP2C19*2和CYP2C19*17基因多態(tài)性與冠狀動(dòng)脈介入治療后病人氯吡格雷反應(yīng)性的關(guān)聯(lián)分析

吳曉峰

目前推薦冠狀動(dòng)脈疾病(CAD)病人接受經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入(PCI)治療后使用雙聯(lián)抗血小板藥物，包括阿司匹林和噻吩并吡啶。目前的指導(dǎo)意見表明，在支架植入后仍持續(xù)該治療至少1年[1-3]。當(dāng)前廣泛應(yīng)用的噻吩并吡啶類抗血小板藥物是氯吡格雷。然而，在使用雙聯(lián)藥物治療過程中，仍有病人出現(xiàn)復(fù)發(fā)性動(dòng)脈粥樣硬化血栓從而導(dǎo)致致命性支架血栓形成。出現(xiàn)這些結(jié)果可能是由于一些病人氯吡格雷的反應(yīng)性低造成的，這種現(xiàn)象被許多科學(xué)家稱為“氯吡格雷耐藥性”[4-5]。平均25%的氯吡格雷治療病人能觀察到這種耐藥性[6-8]。該反應(yīng)的變異性機(jī)制仍不清楚。根據(jù)基因組關(guān)聯(lián)研究，83%對(duì)氯吡格雷反應(yīng)的個(gè)體間差異是由遺傳多態(tài)性引起的[9]。之前有學(xué)者報(bào)道CYP2C19多態(tài)性是響應(yīng)氯吡格雷的血小板反應(yīng)性的主要決定因素[10]。為了探究CYP2C19基因上相關(guān)等位基因(*2和*17)與缺血性事件的發(fā)生及支架血栓形成的關(guān)系，現(xiàn)對(duì)347例經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入的支架植入病人分析結(jié)果如下。

1 資料與方法

1.1一般資料青海省心腦血管病專科醫(yī)院心內(nèi)科選擇2014年3月至2017年3月期間招募了347例經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入的支架植入病人，其中男性206例，女性141例，年齡范圍為54～70歲，年齡(62.5±3.7)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：使用氯吡格雷75 mg/d和阿司匹林150～300 mg/d連續(xù)至少7 d。排除標(biāo)準(zhǔn)：慢性肝病，嚴(yán)重慢性腎功能衰竭，高達(dá)80歲的病人，使用氯吡格雷以外的抗血小板藥，抗凝血?jiǎng)┗驃W美拉唑作為質(zhì)子泵抑制劑，血小板計(jì)數(shù)為低于150×109/L，血細(xì)胞比容值<33%或血清肌酐值>2.5 mg/dL。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求，研究對(duì)象均在知情同意書上簽字。

1.2研究方法

1.2.1基因組DNA提取 用枸櫞酸鈉抗凝管收集空腹靜脈血5 mL，提取試劑盒(QIAamp DNA Blood MiniKit，購于QIAGEN)提取DNA。

1.2.2引物合成 CYP2C19*2與CYP2C19*17基因正向和反向的引物合成序列見表1，引物由北京華博生物技術(shù)有限公司合成。

表1 CYP2C19*2與CYP2C19*17基因引物設(shè)計(jì)

1.2.3聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增 預(yù)變性95 °C 4 min、變性95 °C 30 s、退火56 °C 30 s，延伸72 °C 30 s，72 °C末延伸5 min；共35個(gè)循環(huán)；酶切體系及條件:10X FastDigest Gren Bufer 2μL，F(xiàn)astDigestenzyme 1μL(rs11615使用Eam1105I，rs13181使用AleI)，雙蒸水(ddH2O) 17 μL，PCR產(chǎn)物10 μL；水浴37 °C酶切10 min，然后取出立即置水浴65 °C滅活5 min；使用2%瓊脂糖凝膠，電泳45 min，電壓設(shè)置為145 V。

1.2.4血小板反應(yīng)性的藥效評(píng)價(jià) 為了測(cè)量血小板反應(yīng)性，將每個(gè)樣品收集到含有3.2%檸檬酸鹽的1.8 mL采血管中。然后根據(jù)制造商的說明書使用VerifyNow P2Y12測(cè)定血小板反應(yīng)性。當(dāng)全血樣本中的血小板被二磷酸腺苷(ADP)等激活劑激活后，血小板表達(dá)的糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(GPⅡb/Ⅲa)受體與包被了纖維蛋白原的檢測(cè)珠結(jié)合使血小板發(fā)生聚集，導(dǎo)致全血樣本的透光率增加。聚集的程度與未能被抗血小板藥物有效抑制的血小板受體數(shù)量呈正比，以此反映抗血小板藥物的效果。報(bào)告形式：血小板反應(yīng)單位(PRU)。盡管如此，血小板抑制水平以系統(tǒng)的百分比(%抑制)計(jì)算。根據(jù)對(duì)治療血小板反應(yīng)性定義的共識(shí)，PRU>208與PCI后缺血事件相關(guān)，心血管死亡風(fēng)險(xiǎn)增加。

1.2.5群體代表性檢驗(yàn) 根據(jù)Hardy-Weinberg平衡定律，按以下公式計(jì)算各基因型理論頻數(shù)：CC=np2，CT=2npq，TT=nq2，其中n為樣本量，p、q分別為相應(yīng)的等位基因頻率，分別對(duì)膽囊癌病人組及正常人群組CYP2C19*2(rs4244285)與CYP2C19*17(rs12248560)基因型分布進(jìn)行群體代表性檢驗(yàn)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。采用χ2檢驗(yàn)分析Hardy-Weinberg遺傳平衡定律和兩組間基因型和等位基因頻率分布的差異。氯吡格雷治療的應(yīng)答因素采用多變量logistic回歸分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1氯吡格雷的反應(yīng)通過VerifyNow P2Y12測(cè)定法測(cè)量347名病人的血小板反應(yīng)性(PRU)和抑制值(%)。PRU>208的104例(30%)病人被列為氯吡格雷治療的無應(yīng)答組，其余243例(70%)病人被列為氯吡格雷治療的應(yīng)答組。比較兩組PRU和抑制率(%)，應(yīng)答組與非應(yīng)答組的PRU值分別為(143.0±32.0)、(241.5±26.4)；而應(yīng)答組與非應(yīng)答組的抑制率分別為(41.0±12.0)%、(13.0±7.0)%，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001)。

2.2基因分型結(jié)果在CYP2C19*2(rs4244285)中，氯吡格雷治療無應(yīng)答組GG型57例，GA型40例，AA型7例；氯吡格雷治療應(yīng)答組GG型196例，GA型42例，AA型5例。在CYP2C19*17(rs12248560)中，氯吡格雷治療無應(yīng)答組CC型78例，CT型24例，TT型2例；氯吡格雷治療應(yīng)答組CC型165例，CT型74例，TT型4例。

2.3氯吡格雷應(yīng)答組與無應(yīng)答組的CYP2C19基因型分布CYP2C19*2、CYP2C19*17基因多態(tài)性均存在3種基因型，對(duì)各基因的3種基因型分布經(jīng)χ2檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CYP2C19*2(rs4244285)的基因型分布與其他基因型分布相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.04，P<0.001)。結(jié)果見表2。CYP2C19*2(rs4244285)，G、A等位基因在氯吡格雷應(yīng)答組的分布頻率分別為89.3%、10.7%；在氯吡格雷無應(yīng)答組的分布頻率分別為74.0%、26.0%，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.25，P<0.001)。CYP2C19*17(rs12248560)，C、T等位基因在氯吡格雷應(yīng)答組的分布頻率分別為83.1%、16.9%；在氯吡格雷無應(yīng)答組的分布頻率分別為84.1%、13.1%，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.68，P=0.416)。結(jié)果見表3。

2.4CYP2C19*2、CYP2C19*17多態(tài)性與藥效反應(yīng)的關(guān)系分析CYP2C19*2、CYP2C19*17基因型與藥效反應(yīng)的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)CYP2C19*2的A(突變型)等位基因與CYP2C19*2的G(野生型)等位基因比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.30，P=0.003)，而CYP2C19*2的A/A基因型與CYP2C19*2的G/G基因型比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.81，P=0.031)。CYP2C19*17的C/T基因型與CYP2C19*17的C/C基因型比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.30，P=0.024)。結(jié)果見表4。

2.5CYP2C19*2、CYP2C19*17多態(tài)性對(duì)氯吡格雷治療有反應(yīng)的多因素logistic回歸分析在調(diào)整了其他因素對(duì)氯吡格雷應(yīng)答的影響后，CYP2C19*2(rs4244285)位點(diǎn)基因多態(tài)性與氯吡格雷應(yīng)答相關(guān)(P=0.013)，其調(diào)整OR值為1.773。此外，CYP2C19*17(rs12248560)位點(diǎn)基因多態(tài)性也與氯吡格雷應(yīng)答相關(guān)(P=0.047)，其調(diào)整OR值為1.505。結(jié)果見表5。

3 討論

表2 兩組經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入病人CYP2C19*2和CYP2C19*17基因型頻率分布/例(%)

表3 兩組經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入病人CYP2C19*2和CYP2C19*17等位基因頻率分布/例(%)

表4 兩組經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入病人CYP2C19*2、CYP2C19*17多態(tài)性與藥效反應(yīng)的關(guān)系/例(%)

表5 經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入病人氯吡格雷治療應(yīng)答的多因素logistic回歸分析

氯吡格雷是血小板膜上P2Y12受體的不可逆抑制劑，是一種需要代謝轉(zhuǎn)化的口服前體藥物。在通過ABCB1基因編碼的外排泵腸吸收后，約90%的氯吡格雷通過羧甲酯酶1(CES1)水解成無活性的代謝物。少數(shù)人通過細(xì)胞色素P450(CYP)酶以兩步法轉(zhuǎn)化為活性代謝物。然后氯吡格雷的活性代謝物不可逆地與由P2Y12基因編碼的腺苷二磷酸受體(ADP)結(jié)合，并抑制由涉及血小板聚集的ITGB3基因編碼的糖蛋白Ⅱb/Ⅲa復(fù)合物的活化[11]。先前的研究指出了參與編碼氯吡格雷生物活化途徑的蛋白質(zhì)的基因變異，特別是CYP酶由于其多態(tài)性而引起關(guān)注[12]。CYP2C19多態(tài)性是響應(yīng)氯吡格雷的血小板反應(yīng)性的主要決定因素。這個(gè)發(fā)現(xiàn)首先由Kim等發(fā)表[13]，并由Holmes等[14]進(jìn)一步完善。通過遺傳和臨床研究已經(jīng)在CYP2C19基因上檢測(cè)到其相關(guān)等位基因(如CYP2C19*2)的功能喪失與缺血事件和支架血栓形成風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[15]。相反，同一基因的不同等位基因(如CYP2C19*17)的增益功能變異與氯吡格雷活化增加有關(guān)[16]。

本次研究的結(jié)果顯示，CYP2C19*2(rs4244285)基因型與等位基因頻率分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且CYP2C19*2(rs4244285) A/A基因型和A等位基因與氯吡格雷的應(yīng)答顯著相關(guān)，此外CYP2C19*17(rs12248560)C/T基因型也與氯吡格雷的應(yīng)答顯著相關(guān)，說明了兩個(gè)CYP2C19基因多態(tài)性是響應(yīng)氯吡格雷的血小板反應(yīng)性的主要決定因素。在后續(xù)研究中我們需進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)果。本次研究發(fā)現(xiàn)在CYP2C19*2(rs4244285)和CYP2C19*17(rs12248560)基因型與病人對(duì)氯吡格雷治療反應(yīng)之間的相關(guān)性，可能是由于多種蛋白質(zhì)在抗血小板活性形成中的相互作用而造成的。

盡管以形成有效的抗血小板活性的新型抗血栓藥(普拉格雷，替卡格雷)逐漸走在前列，但氯吡格雷在世界各地仍然普遍使用。由于新一代藥物導(dǎo)致的出血風(fēng)險(xiǎn)增加和銷售價(jià)格較高，氯吡格雷在抗血小板治療中將保持其重要性。通過血小板聚集測(cè)定，我們證實(shí)了CYP2C19*2(rs4244285)和CYP2C19*17(rs12248560)基因型對(duì)氯吡格雷藥效學(xué)的影響。