烏頭類中藥有效成分的含量測定研究

王丕明

烏頭類是臨床常用的一種中藥，以烏頭堿等生物堿為主要毒性成分，如果人類要口服3～5 mg烏頭堿，則會導致死亡的發生。烏頭堿以循環系統、中樞神經系統為主要的損害器官，其中心律失常為循環系統損害的主要表現。目前，臨床對于該藥物的毒性尚無特效解毒劑，臨床多予以患者早期、足量的阿托品、抗心律失常等藥物進行治療，對于中毒較深的患者，則多采取血液灌流治療。烏頭類中藥中含有多種生物堿，例如烏頭次堿、烏頭堿、新烏頭堿等[1]。在烏頭類中藥中，生物堿成分既屬于活性成分，也屬于毒性成分，且該藥物多采取炮制方法入藥，因此，其質量與臨床用藥的安全性具有直接關系。為保證臨床用藥的安全性，在本次研究中，以烏頭類中藥中新烏頭次堿這一有效成分作為研究指標，并對其含量進行測定，現詳細報道如下。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑儀器：在本次研究中應用的主要儀器包括高效液相色譜系統、色譜工作站，在高效液相色譜系統中包括柱溫箱(杭州瑞析科技有限公司)、在線真空脫氣機(汕頭市科毅儀器設備有限公司)、自動進樣器(上海思達分析儀器有限責任公司)、二元梯度泵(杭州瑞析科技有限公司)、二極管陣列檢測器(蘇州普源精電科技有限公司)等。試劑：在本次研究中應用的主要試劑乙腈(色譜純)、雙蒸水，分析純：附子、新烏頭次堿標準品。

1.2檢驗方法

1.2.1新烏頭次堿的鑒定對于新烏頭次堿的確定，主要采取13C-NMR、1H-NMR、質譜及紫外等方法進行確定，并應用高效液相色譜系統對其純度進行測定。

1.2.2附子中生物堿含量測定應用LC-MSn法初步對附子中生物堿成分進行鑒定，對鑒定后的離子強度進行判定，新烏頭次堿屬于烏頭類中藥生物堿中含量最高的成分。

1.3含量測定方法對于新烏頭次堿的含量測定方面，關于色譜條件：色譜柱為230 mm×2.0 mm，3 μm，流動相：氨水溶液，濃度為0.01%(a)，乙腈(b)，檢測波長：200 nm，柱溫：20℃，梯度洗脫：80%(b)，間隔40 min40%(b)，間隔15 min 40%(b)，流速：1 ml/min。在溶液制備方面：對于供試品溶液：取1 g樣品粉末，該粉末過20目篩，予以樣品精密稱定，并置入錐形瓶中，在錐形瓶中加入濃度為10%，劑量為2 ml的氨水溶液，使其浸潤粉末，同時量取25 ml乙醚(保證精密性)，用超聲提取，時間為30min，取出提取后的上清液，用乙醚對殘渣進行洗滌，次數在2～3次左右，每次在3～5 ml，將提取液、洗滌后的乙醚液予以合并，放置在溫度為40～50℃的水浴中，將乙醚揮干，并用濃度為0.01%計量為8～10 ml的鹽酸-甲醇進行溶解，用直徑為0.40μm的慮膜進行慮過，將慮液作為本次研究的供試品溶液。

1.4數據計算以相對標準偏差分析測試結果的精密度，相對標準偏差(RSD)=標準偏差(SD)/計算結果的算術平均值(X)×100%

2 結果

2.1線性關系結果準確的吸取標準品儲備液，劑量分別為1.0 ml、1.5 ml、2.0 ml，并將其置入量瓶中(10 ml)，用鹽酸-甲醇稀釋(濃度為0.01%)對其進行稀釋至刻度，搖晃均勻，得到系列的標準溶液，準確吸取劑量為10 μl，將其注入值液相色譜儀中，進行測定，進行線性分析中，橫坐標(X)為峰面積積分值，縱坐標(Y)為進樣量，線性回歸結果顯示，Y=301.2X-3.51(r=0.9994)，說明新烏頭次堿進樣量在0.46～10.0 μg，與峰面積積分存在線性關系。

2.2精密度及穩定性結果準確吸取供試品溶液(同一樣品)10 μl，將其注入值液相色譜儀中進行分析，并重復3～5次，結果顯示，新烏頭次堿峰面積RSD=0.49%，可見其精密度較好；對于穩定性分析，準確吸取供試品溶液(同一樣品)10 μl按照色譜中制定的條件在0 h、4 h、12 h、24 h時分別將其注入值液相色譜儀中，對其進行測定，結果顯示，新烏頭次堿峰面積RSD=1.35%，說明在24 h內該供試品溶液具有較好的穩定性。

2.3加樣回收率試驗取新烏頭次堿含量為0.35 mg/g的附子樣品，共4份，編號為1、2、3、4，選取合適的劑量加入新烏頭次堿標準儲存備液中，以研究中制定的供試品溶液為參照，在色譜條件下進行分析，對加樣回收率進行計算，結果顯示，4份不同樣品含量的加樣回收率分別為101.05%、100.32%、102.14%、103.28%，詳細見表1。

表1 加樣回收率試驗數據 (例，%)

2.4樣品含量測定結果共選取2個批次的樣品，按照供試品溶液的制備方法進行制備，并予以色譜測定，重復3～5次，取其平均值，對附子中新烏頭次堿的含量進行計算，批次1平均含量為0.352 mg/g，RSD值為1.24%，批次2平均含量為0.281 mg/g，RSD值為1.55%，詳細結果見表2。

表2 不同批次的附子中新烏頭次堿含量測定結果 (例，%)

3 討論

烏頭類中藥具有十分悠久的歷史，烏頭類中藥材有很多，例如附子、草烏、川烏等，其中以草烏、川烏入藥最早[2]。中醫學中認為烏頭類藥物具有大毒、大熱的功效，例如附子，具有救逆、回陽的功效，因此在臨床陽虛、陰盛的治療中廣泛應用，烏頭具有止痛、祛濕的功效，在風濕性關節炎的治療中得到廣泛的應用。現代藥理學中發現，對于烏頭類生物堿是烏頭類藥物的主要成分，該成分不但存在活性，還具有一定的毒性作用，因此，測定烏頭類生物堿的含量，對臨床的安全用藥具有重要的意義[3]。

臨床中應用的中藥多采取炮制方法入藥，但因缺乏標準品，且儀器使用受到限制，致使臨床不得不以《中國藥典》為基準，通過對烏頭堿最低檢測量進行限制，從而使其質量得到保障，同時減少臨床的用藥劑量、優化應用方法，旨在最大程度保證臨床用藥安全[4]。新烏頭次堿是烏頭堿類中藥中主要的藥效成分，因此，對新烏頭次堿的含量進行測定，可以有效控制其含量，達到用藥的安全[5，6]。對本次研究結果分析，新烏頭次堿進樣量在0.46～10.0 μg，與峰面積積分存在線性關系，在對精準性、穩定性方面測定中，新烏頭次堿峰面積分別為RSD=0.49%、RSD=1.35%，有效的證實了新烏頭次堿的精準性、穩定性，且不同樣品含量加樣回收率較高，對4份不同樣品含量分析，數據分別為101.05%、100.32%、102.14%、103.28%，證實該方法樣品含量的回收率也相對較高，此外，對不同批次樣品新烏頭次堿含量測定，其平均含量分別為0.352 mg/g、0.281 mg/g，RSD值分別為1.24%、1.55%，綜合性分析，說明該方法可以初步確定烏頭類中藥中新烏頭次堿的含量。劉帥等[7]學者指出，烏頭類中藥在治療劑量、中毒劑量上十分接近，且治療窗狹窄，導致臨床該藥物應用中不良事件、中毒事件發生率高，進而在臨床應用存在一定的局限性。黃玉明等[8]學者對烏頭類中藥中毒的原因分析，主要包括以下幾個方面：1)烏頭類中藥超劑量應用：經過大量的實踐總結發現，對于烏頭類藥物的科學應用劑量在1～3 g左右，但在實際臨床應用中，人們為了提高藥物的效果，往往會加大劑量，導致烏頭類藥物劑量過大，而出現毒性反應。2)藥物配伍問題：烏頭類中藥配伍禁忌多，例如烏頭類藥物與麻黃、犀角等藥物配伍后，則會誘發中毒反應的發生。3)藥物炮制煎煮問題：烏頭類藥物，如果缺乏科學的炮制，不能使藥物完全發揮藥力，且如果煎煮時間不當，也會增加藥物的毒性。4)服藥方法錯誤：傳統的烏草多采取泡酒、燉肉等方式進行服藥，缺乏精細的加工，如果人們常時間按照該方法服藥，則會導致中毒反應的發生。楊翠榮[9]對37例烏頭類中毒患者采取藥物、洗胃、催吐、血液灌流等方式治療后，藥物方面主要選取阿托品治療，其原因是阿托

品可以興奮抗迷走神經，接觸房室結的抑制作用，從而改善患者的呼吸抑制癥狀，達到治療目的；血液灌流主要用于中毒嚴重的患者，其原因是烏頭類中生物堿含量大、脂溶性強、水溶性不佳，采取血液灌注，可以提高整體療效。所有患者經治療后，在1周內均痊愈，但在治療期間需要注意的問題是要嚴格控制藥物的劑量，保證藥物的合理配伍，從而減少患者盲目用藥，提高患者的臨床療效。此外，筆者還發現，如果以《中國藥典》中的方法操作，烏頭類生物堿含量低、炮制方法不當等均可以使偽劣藥品通過質檢，并用于臨床的治療中，這樣易降低患者的用藥效果，因此，需要對新烏頭次堿的含量予以一定的控制，從而提高烏頭類中藥的質量。

綜上所述，高效液相色譜法可以廣泛的用于烏頭類中藥的測定中，精準性高、穩定性好，值得廣泛的應用。