標準加入法測定豬肉中磺胺二甲嘧啶和磺胺二甲氧嘧啶殘留量

楊修鎮 尹伶靈 陳 玲 張呈軍 牛華星 劉少寧

（山東省獸藥質量檢驗所 山東省畜產品質量安全監測與風險評估重點實驗室 山東 濟南 250022）

標準加入法是指取一定量被測物質標準溶液精確加入到待測樣品中，根據加入被測物質標準溶液前后儀器測定響應值來計算待測樣品中被測物質量的一種方法。依據：A前/A后=X前/(X前+X加入) 得出：X前＝X加入/[(A后/A前)－1]式中：A前為加入被測物質標準溶液前待測樣品的儀器響應值；A后為加入被測物質標準溶液后待測樣品的儀器響應值；X前為待測樣品中被測物質的量(未知)；X加入為待測樣品中加入被測物質的量(精確加入)。

在分析中為了消除樣品基質干擾，提高測定準確度，往往推薦標準加入法，這種方法在原子吸收分光光度法、離子選擇性電極法、分光光度法、極譜法、氣相色譜法中應用尤多[1～3]。本實驗室2018年6月參加農業農村部農產品質量安全監管局組織的豬肉中磺胺類藥物殘留量能力驗證考核時，按照GB/T 20759-2006進行了檢測，檢出陽性藥物磺胺二甲嘧啶和磺胺二甲氧嘧啶。但由于組織方未提供空白樣品本底，本實驗室自行選取的本底與考核樣品出現基質不匹配，致使定量結果異常。由于缺乏被測藥物同位素內標無法采用內標法消除基質效應影響，故采用標準加入法測定了豬肉中磺胺二甲嘧啶和磺胺二甲氧嘧啶殘留量。采用該方法后，本實驗室取得了滿意定量結果并順利通過能力驗證考核。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Waters Xevo TQ-S高效液相-串聯質譜儀；電子天平(感量0.01g、0.00001g)；均質機；渦旋混合器；旋轉蒸發儀；離心機；有機濾膜(0.22μm)；磺胺二甲嘧啶標準物質(德國Dr公司，含量≥98%)；磺胺二甲氧嘧啶標準物質(德國Dr公司，含量≥98%)；生鮮豬肉(購于超市)；乙酸銨為優級純，乙腈、甲醇、異丙醇、正己烷為色譜純；水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.2 標準溶液配制

精密稱取磺胺二甲嘧啶標準物質和磺胺二甲氧嘧啶標準物質各10mg，置同一10ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為1mg/ml的混合標準貯備液。精密量取混合標準貯備液500μL，置100ml容量瓶中，用10%乙腈溶液稀釋至刻度，配制成濃度為5μg/ml的混合標準溶液。

1.3 樣品前處理

1.3.1 加入被測物質標準溶液前樣品前處理 根據參考文獻[4]方法，稱取試樣5.0g(精確至0.01g)置50ml離心管中，加入20g無水硫酸鈉和20ml乙腈，均質2min，以8000r/min離心3min，上清液倒入100ml雞心瓶中，殘渣加入20ml乙腈，重復上述操作一次。合并提取液，向雞心瓶中加入10ml異丙醇，用旋轉蒸發儀于50℃水浴蒸干，準確加入1ml 10%乙腈溶液和1ml正己烷溶解殘渣。轉移至5ml離心管中，渦旋1min，以8000r/min離心3min，吸取上層正己烷棄去，再加入1ml正己烷，重復上述步驟，直至下層變成透明液體。取下層溶液，過0.22μm濾膜，供上機測定。

1.3.2 加入被測物質標準溶液后樣品前處理 稱取試樣5.0g(精確至0.01g)置50ml離心管中，精確加入5μg/ml的混合標準溶液100μl后，自“加入20g無水硫酸鈉和20ml乙腈”起按加入被測物質標準溶液前樣品前處理方法制備，即得。

1.4 測定方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱：C1850mm×2.1mm，粒徑1.7μm；流動相：A相為乙腈，B相為0.01mol/L乙酸銨溶液；流速：0.3ml/min；進樣量：2μl；柱溫：35℃；洗脫條件如表1。

表1 流動相梯度洗脫條件

1.4.2 質譜條件 根據參考文獻[5～7]方法，電離模式：電噴霧正離子(ESI+)，毛細管電壓：3v，離子源溫度：150℃，脫溶劑溫度：350℃，脫溶劑氣流速：550L/h.，脫溶劑氣、錐孔氣、碰撞氣均為高純氮，采集方式：多反應監測(MRM)，磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶的定性和定量離子見表2。

表2 磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶特征離子參考質譜條件

1.4.3 方法的準確度和精密度 采用標準添加法，取3批空白豬肉，每批中添加磺胺二甲嘧啶和磺胺二甲氧嘧啶50、100、200μg/kg 3個不同濃度(添加量分別為1/2MRL、MRL、2倍MRL)，每個濃度進行6份，其中1份按加入被測物質標準溶液前樣品前處理方法制備，5份按加入被測物質標準溶液后樣品前處理方法制備，經高效液相色譜－串聯質譜儀測定，按標準加入法計算回收率。

2 結果與分析

2.1 準確度和精密度

在空白豬肉中添加3個不同濃度的磺胺二甲嘧啶和磺胺二甲氧嘧啶后按標準加入法進行回收率試驗，結果見表3。

表3 豬肉中磺胺二甲嘧啶和磺胺二甲氧嘧啶的添加回收率

2.2 能力驗證考核樣品結果

本實驗室首先按照GB/T 20759-2006對能力驗證考核樣品進行了檢測，由于組織方未提供空白樣品本底，存在自行選取的本底與考核樣品出現基質不匹配帶來定量不準確的風險。本實驗室又采取標準加入法進行了測定，結果表明兩種定量方法測定的數值存在較大差異。本實驗室以標準加入法的結果進行了上報，順利通過了能力驗證，結果見表4。

3 討論與小結

液相色譜串聯質譜法由于高分離效能、高選擇性和高靈敏度適用于復雜樣品中藥物及其代謝產物的測定，其中以電噴霧電離(ESI)方式應用最為廣泛，其電離方式固有的基質效應問題也逐漸引起人們的關注。基質效應的產生源于待測組分與樣品中的基質成份在霧滴表面離子化過程的競爭，其競爭結果會顯著降低或增強目標離子的生成效率及離子強度，進而影響測定結果的精密度和準確度[8]。由于基質中某些干擾組分的存在會使待測組分離子生成的速度與標準品相比有顯著不同，為平衡這種差異2010年以前發布的檢測標準大多采用基質匹配標準曲線法。但在實際檢測中，因所測樣品具有不同的來源(例如我國生豬品種多達60多種，飼養技術及飼養環境也是千差萬別[9,10]，同時受屠宰、運輸、保存等影響)，使得樣品基質與基質匹配標準溶液的基質仍有較大差異，使得含同樣濃度目標化合物的不同來源樣品的測定結果大不相同。為解決這一問題同位素內標法被廣泛采用，由于被測化合物與其同位素內標具有幾乎完全一致的化學性質和不同的質荷比，不但可以平衡基質效應的影響還可以減少前處理的操作誤差和系統誤差。但是同位素內標往往比較昂貴或者難以獲得，在不具備同位素內標的情況下仍需獲得準確定量結果時就需要采用標準加入法。標準加入法由于是在樣品本身中進行添加，其同樣可以平衡基質效應的影響，但依據其定量原理，操作往往較為復雜，標準溶液加入前及加入后均需準確測定，對操作者的要求較高。

本文主要是在GB/T 20759－2006的基礎上變換定量方法，因此著重對準確度和精密度進行了研究未對專屬性、線性范圍、檢出限等一致內容進行累述。采用標準加入法定量之前需先對樣品進行預試驗來評估樣品中被測物質的量，加入量宜與樣品中的量接近，如差距甚遠仍會使定量不準確。