利安辛與雞馬立克氏病疫苗混合使用的試驗觀察

張會霞 張 慧 孫芹芹 李 悅 姜勝男 曹勝亮

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 山東 泰安 271018）

當(dāng)前滑液囊支原體通過垂直和水平均可傳播，并可長期帶毒，是獸醫(yī)臨床上一種常見的、高發(fā)的傳染病。雞群一旦感染發(fā)病即難以徹底根除，而且藥物治療效果都不太理想，必須反復(fù)輪換用藥，控制病情與繼發(fā)感染[1]。鹽酸大觀霉素是氨基環(huán)醇類廣譜抗生素，對革蘭陽性菌和革蘭氏陰性菌均有抗菌作用[2]。林可霉素屬林可酰胺類抗生素，主要用于治療革蘭氏陽性菌引起的感染性疾病[3]。大觀霉素及林可霉素均可與細(xì)菌核糖體亞基結(jié)合，能夠有效抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，臨床上常見配伍應(yīng)用于細(xì)菌性疾病尤其是支原體病的預(yù)防及治療，具有成本低、抗菌譜廣、降低耐藥性等優(yōu)點。利安辛，是魯抗利用自產(chǎn)原料鹽酸大觀霉素與林可霉素按2：1比例配伍的復(fù)方制劑，在控制雞沙門氏菌，尤其是滑液囊支原體疾病方面療效確切。為驗證利安辛(鹽酸大觀霉素鹽酸林可霉素可溶性粉)對雞馬立克氏病疫苗免疫效果是否有影響，做了以下試驗。

1 材料和方法

1.1 材料

雞馬立克氏活疫苗CVI988/Ripens株)及其稀釋液購自乾元浩生物股份有限公司；利安辛(30g/瓶，鹽酸大觀霉素鹽酸林可霉素可溶性粉)由山東魯抗舍里樂藥業(yè)有限公司高新區(qū)分公司提供，生產(chǎn)批號：1810001；SPF雞胚購自濟(jì)南家禽所。胎牛血清及PBS購自BI公司，DMEM培養(yǎng)基購自Gibco，胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%)及青鏈霉素混合液(100×)購自北京索萊寶。

1.2 試驗分組

空白對照組：正常雞馬立克氏疫苗，不加任何抗生素；試驗組一：100ml稀釋液中加入3.75g利安辛；試驗組二：100ml稀釋液中加入5g利安辛。

1.3 試驗方法

1.3.1 CEF細(xì)胞制備 選取9～11日齡SPF雞胚按常規(guī)方法制備CEF細(xì)胞，用5%FBS的培養(yǎng)基以5×106/ml的密度接入一次性100MM平皿培養(yǎng)20～24h確保細(xì)胞鋪成單層，待細(xì)胞長至單層后將初代細(xì)胞用0.25%胰酶消化，以8×106/ml的密度鋪至96孔板，在細(xì)胞長成單層后，進(jìn)行接種疫苗。

1.3.2 準(zhǔn)備疫苗及藥品 雞馬立克氏病活疫苗(CVI988/Rispens株)從液氮罐中取出后立即按照常規(guī)使用方法稀釋至工作濃度(病毒濃度約為3000PFU/0.2ml)，從稀釋好的疫苗液中分別取出3份，100ml/份，然后向這3份稀釋液液中依次迅速加入利安辛可溶性粉0、3.75、5g(相當(dāng)于每羽份疫苗液中添加的利安辛分別為0、0.375、0.5mg)。

1.3.3 疫苗稀釋及接種 96孔板棄掉培養(yǎng)基，PBS清洗2次，每孔加100ul1%FBS的維持液。然后分別取9個1.5ml高壓過的離心管，在離心管中加入500ul維持液和500ul加入抗生素的疫苗稀釋液，即2倍稀釋，以同樣的方法進(jìn)行2倍逐級稀釋，稀釋至26。30min后取100ul稀釋好的疫苗抗生素混合液，加入96孔板第二列(8個重復(fù))，然后2倍逐級稀釋至第12列，最后棄掉100ul。45min、60min按上述同樣操作進(jìn)行。放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)7d，觀察每行的蝕斑情況，記錄最后一個出現(xiàn)蝕斑的稀釋倍數(shù)及蝕斑個數(shù)。馬立克疫苗的效價通過蝕斑計數(shù)的方法進(jìn)行計算，根據(jù)蝕斑數(shù)的平均值以及對應(yīng)的稀釋倍數(shù)，計算出MDV的含量，以每毫升病毒蝕斑形成單位(PFU)為單位[4]。

1.4 統(tǒng)計分析

將試驗測得的數(shù)據(jù)應(yīng)用軟件SPSS23.0軟件進(jìn)行差異顯著性檢驗，分別比較各作用時間點不同濃度利安辛添加組與未添加該藥物的馬立克疫苗空白對照組的差異以及同一藥物處理組不同時間點的蝕斑數(shù)差異，各組間蝕斑變化差異采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

在雞馬立克氏疫苗稀釋液中加入利安辛可溶性粉之后，進(jìn)行細(xì)胞實驗蝕斑檢測，并進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果見附表，將數(shù)據(jù)用GraphPadPrism7作圖分析，結(jié)果見附圖。

附表 各試驗組在各時間點的病毒蝕斑數(shù) (PFU/ml)

結(jié)果分析表明：（1）在稀釋好的100ml疫苗液中分別加入3.75g(試驗組1)和5g(試驗組2)利安辛，26℃作用30min和45min對疫苗病毒蝕斑數(shù)沒有顯著影響，但作用60min后，試驗組一與未添加藥物相比差異極顯著(P＜0.01)。（2）隨著添加藥物濃度的提高，病毒蝕斑數(shù)的下降程度越來越嚴(yán)重。（3）無論是對照組還是實驗組，隨著作用時間的延長，病毒蝕斑數(shù)都有所下降。

附圖 利安辛對馬立克疫苗的影響

3 結(jié)論

利安辛，是魯抗利用自產(chǎn)原料鹽酸大觀霉素與林可霉素按2：1比例配伍的復(fù)方制劑，在控制雞沙門氏菌、大腸桿菌病尤其是滑液囊支原體病方面療效確切。為了控制或凈化雞胚細(xì)菌感染，減少雛雞的早期細(xì)菌感染，人們常將利安辛與雞馬立克氏病疫苗聯(lián)合使用。前期臨床用藥證明利安辛與馬立克疫苗聯(lián)合應(yīng)用對滑液囊支原體有良好的治療作用，通過本試驗數(shù)據(jù)顯示，利安辛在一定劑量下對雞馬立克氏病疫苗效價沒有顯著影響，說明利安辛與雞馬立克氏病疫苗聯(lián)合使用不會影響疫苗免疫效果。另外從本試驗的數(shù)據(jù)也可以看出，在未添加利安辛的對照組，疫苗稀釋后60min后測定的病毒蝕斑數(shù)也有所降低，建議疫苗在稀釋后45min之內(nèi)用完。