黑沙蒿對阿爾巴斯白絨山羊體外瘤胃發酵參數的影響

■馬國強 張清月 胡 耀 趙艷麗 郭曉宇 閆素梅

（內蒙古農業大學動物科學學院，內蒙古呼和浩特010018）

我國是一個羊絨生產大國，長期以來是畜牧產業出口創匯的一個重要來源，2012年羊絨產量大約占全球的70%左右[1]。近年來隨著羊絨價格的下跌，羊肉需求量的不斷增加，同時伴隨著草原生態環境的惡化，草場載畜量的限制等因素，使得舍飼育肥絨山羊逐漸成為新的經濟增長點[2]。但在由放牧轉為舍飼過程中，日糧的的改變可能會引起瘤胃內微生物區系的變化，加之舍飼日糧可溶性碳水化合物濃度高，有效纖維不足，可能會引起pH值下降，導致酸中毒等消化功能障礙，影響機體健康和生產性能[3]。因此，開發一種能夠提高機體抵抗力，促進動物生長的飼料添加劑尤為重要。

黑沙蒿，又名沙蒿、油蒿，是蒿屬植物中的一個品種。作為一種中草藥添加劑，其功能多樣，富含各種多糖、黃酮類、有機酸等有機活性物質，全草均可入藥[4]。有研究發現黑沙蒿具有抑制細菌、提高機體免疫力、促進動物發育等功能[5]，且具有芳香氣味，可一定程度上改善飼料風味[6]。因其不易殘留，出現抗藥性和毒副作用幾率較低，飼用更為安全穩定，具有被開發為一種新型綠色飼料添加劑的潛力。但目前關于黑沙蒿的研究多集中于單胃動物以及其對免疫、抗氧化功能等的影響，關于黑沙蒿對反芻動物瘤胃發酵性能影響的報道鮮少。鑒于此，本試驗通過體外發酵培養，在日糧中添加不同比例的黑沙蒿，探究其對瘤胃發酵參數的影響，為黑沙蒿在絨山羊生產中的科學應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

本試驗分5個組，即對照組、試驗1組、試驗2組、試驗3組和試驗4組，分別在其發酵底物中添加0%、1%、2%、3%、4.5%的沙蒿原粉（沙蒿等量替代發酵底物中的混合粗料）。每個組設3、6、9、12 h與24 h 5個發酵時間點，每個發酵時間點6個重復。體外發酵底物的精粗比為30∶70，粗料由谷草、燕麥、苜蓿組成。每個發酵瓶中添加1 g底物，接種60 ml人工瘤胃液。待培養結束后進行取樣及樣品處理。體外發酵底物的組成與營養水平見表1。

1.2 體外培養操作

選取3只年齡相同、體況相近且健康的阿爾巴斯白絨山羊作為瘤胃液供體羊，于早晨飼喂前用瘤胃液采樣器通過口腔采集瘤胃液。采集到的瘤胃液經一層紗布過濾到提前充滿CO2的保溫瓶中保存，采集完畢后立即放入39℃水浴中保存。將采集好的瘤胃液與配置好的培養液混合均勻，制成人工瘤胃液，持續通入CO2，待由紅色變為無色時，再將其依次分配到裝有底物的各個培養瓶中。在培養瓶中接種人工瘤胃液之前，培養瓶中預先通滿CO2，在接種人工瘤胃液之后，再通入CO21～2 s，蓋好瓶塞之后立即將其轉移到氣浴搖床中，溫度為39.0℃，搖床速率為120 r/min。待各時間點培養結束后，立即將發酵瓶置于冰上進行冷卻，以確保各發酵瓶同時終止發酵。再按照順序依次進行取樣。

表1 體外發酵底物的基礎日糧組成與營養水平

體外培養液的配置參考Menke等(1988)[7]的方法。由瘤胃液與人工培養液以1∶2的比例配制而成。人工培養液包含緩沖溶液、微量元素溶液、常量元素溶液、刃天青溶液、還原劑溶液等,在采集瘤胃液前配制,并提前充入CO2于39℃水浴中加熱。

1.3 測試指標與測定方法

測試指標包括體外培養3、6、9、12、24 h時間點的pH值、NH3-N、菌體蛋白(BCP)濃度，原蟲數量和產氣量。在相應時間點，待培養完畢之后，將發酵瓶內液體搖勻，打開瓶塞之后，倒出少許發酵液，立即用pH計測其pH值。NH3-N濃度參照馮宗慈等（2010）[8]改進的比色法，采用水楊酸-次氯酸鈉法測定，用酶標儀在700 nm波長下進行吸光度檢測，將測得的吸光值代入標準曲線回歸公式，計算樣品中的NH3-N濃度。菌體蛋白（BCP）濃度參考趙發盛等[9]方法測定，采用差速離心法對體外培養液中的細菌進行分離，將分離后菌體采用考馬斯亮藍法（Bradford等，1976）測定蛋白含量[10]。

原蟲計數參考王洪榮等[11]的方法采用染色鏡檢法進行測定。將用2層紗布過濾后的瘤胃液置于血球計數板上用光學顯微鏡對其進行觀察計數。計數時記錄上下兩個計數室各自四角和中間的5個大方格內原蟲的數量，然后對其進行平均計算。

計算公式：實際濃度(個/ml)=上下板總數(個)×104

產氣量的測定采用美國Ankom RFS氣體自動記錄系統記錄體外培養液中24 h內的產氣量[12]。計算公式：

式中：VX——產生氣體的體積（ml）；

Vj——模塊瓶內液面上部空間的體積（ml）；

Ppsi——GMS軟件記錄的累計壓力（psi）。

1.4 數據統計分析

試驗數據采用SAS 9.0軟件的統計程序進行單因素方差分析，統計結果P＜0.05表示組間差異，0.05＜P＜0.10表示組間差異趨于顯著，P＞0.10表示組間差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 黑沙蒿對體外發酵培養液pH值的影響

表2 黑沙蒿添加水平對體外培養液中的pH值的影響

由表2可知，發酵3 h與6 h，黑沙蒿的不同添加水平對體外發酵培養液中的pH值有顯著影響（P=0.035、P=0.005）。其中在發酵3 h，試驗1～3組的pH值均顯著高于對照組，且在數值上試驗2與3組最高；在發酵6 h，試驗1與4組的pH值顯著高于對照組，且試驗4組顯著高于試驗1組，試驗2、3組與對照組差異不顯著。在發酵9、12、24 h，黑沙蒿的不同添加水平對體外發酵培養液中的pH值均沒有顯著影響（P＞0.10）。

2.2 黑沙蒿對體外發酵培養液中NH3-N含量的影響

表3 不同發酵時間點各黑沙蒿添加水平體外培養液中的NH3-N濃度（mg/100 ml）

由表3可知，在發酵3、6、9、12、24 h，黑沙蒿的不同添加水平對NH3-N的濃度均有顯著影響（P＜0.05）。其中，在發酵3 h，試驗2～4組的NH3-N濃度顯著低于對照組；在發酵6 h后，試驗1、3組與4組的NH3-N濃度顯著高于對照組，以試驗3組較高；在發酵9 h，試驗3、4組的NH3-N濃度顯著高于對照組；在發酵12、24 h，試驗1～4組的NH3-N濃度顯著高于對照組，且在發酵24 h，試驗3組顯著高于試驗2組。

2.3 黑沙蒿對體外發酵培養液中BCP含量的影響

表4 黑沙蒿添加水平對體外發酵培養液中BCP含量的影響（mg/100 ml）

由表4可知，在發酵3、6、9、24 h，黑沙蒿的不同添加水平對體外培養液中BCP的含量均有顯著影響（P＜0.05）。在發酵3 h，試驗3、4組的BCP含量顯著高于對照組與試驗1、2組；在發酵6 h，試驗1～4組的BCP含量顯著高于對照組；在發酵9 h，試驗1、3、4組的BCP含量顯著高于對照組；在發酵24 h，試驗1～3組的BCP含量均顯著高于對照組，試驗4組與對照組無顯著差異，且顯著低于試驗3組。

2.4 黑沙蒿對體外培養液中原蟲數量的影響

由表5可知，在發酵3、6、12 h和24 h，黑沙蒿的不同添加水平對原蟲的數量有顯著影響（P＜0.05）。在發酵3 h，試驗2組顯著高于對照組與試驗1、4組；在發酵6 h，試驗2、3組顯著低于對照組與試驗1、4組；在發酵12 h，試驗1～3組顯著低于對照組與試驗4組，且試驗3組最低，顯著低于試驗1與2組；在發酵24 h，試驗2～4組顯著低于對照組，試驗1組與對照組差異不顯著。

表5 不同發酵時間點各黑沙蒿添加水平體外發酵培養液中原蟲的數量（×104個/ml）

2.5 黑沙蒿對體外發酵培養液產氣量的影響

由表6可知，在發酵所有時間點，黑沙蒿的不同添加水平對體外產氣量均有顯著影響（P＜0.05）。其中在發酵3 h，試驗4組顯著高于對照組、試驗1與3組；在發酵6 h，試驗2與4組顯著高于對照組。在發酵9 h和12 h，所有試驗組顯著高于對照組，且在發酵12 h，試驗4組顯著低于試驗2、3組；在發酵24 h，試驗2～4組顯著高于對照組。

表6 黑沙蒿添加水平對體外產氣量的影響（ml）

3 討論

pH值是反應瘤胃發酵水平的一個重要指標，瘤胃中pH值的正常變動范圍為5.5～7.5，瘤胃細菌繁殖最適pH值范圍6～7，微生物蛋白質合成最適pH值范圍為6.3～7.4[13]。pH值的改變可顯著影響瘤胃微生物的活性，進而影響微生物各種酶的活性。姜衛紅等[14]研究指出，纖維素分解型細菌受pH值的改變影響最大，而淀粉型分解細菌對pH值的改變不敏感[15]。pH值一般受日糧的性質、口腔唾液的分泌量以及瘤胃內揮發性脂肪酸的生成與吸收等諸多因素影響[16]，但在體外培養試驗中，因為沒有唾液的分泌以及代謝產物的外排作用，因此影響瘤胃液pH值變化的主要因素是CO2、各種有機酸以及NH3-N的釋放與轉化。NH3-N的含量在一定程度上反映了瘤胃微生物降解氮源飼料的速率及其對游離NH4+的轉化效率，進而反映了在特定日糧組成下，蛋白質降解與合成的平衡狀態[17]。有研究指出瘤胃中微生物對NH3-N的最適濃度一般為6～30 mg/100 ml。一般情況下瘤胃液中的NH3-N濃度處于動態平衡，但NH3-N水平不僅受日糧中含氮飼料占比的影響，同時受蛋白降解率、瘤胃微生物對NH3-N的利用速率和瘤胃對NH3-N的吸收速率以及日糧能量水平等因素影響[18]。BCP的含量直接反映瘤胃中細菌的數量，并且反應微生物蛋白的合成效率。陳喜斌等[19]指出可降解N轉化為BCP的效率受NH3-N濃度、蛋白降解速度及微生物可利用能量的影響。瘤胃中的原蟲與細菌處于動態平衡中，原蟲以細菌為食物來源，對細菌的氮代謝有重要的調節作用。原蟲不能直接利用氮素，只有通過吞噬細菌而獲得氨基酸氮，從而合成自身蛋白。有研究表明，適當的降低瘤胃中原蟲的數量，可提高瘤胃細菌的數量，增加對蛋白的合成效率[20]。產氣量可直接反映瘤胃降解代謝二氧化碳、甲烷及各種揮發性氣體的產量，可間接反映飼料有機物質的消化率，產氣量越高，飼料在瘤胃內的發酵活動越劇烈。

本試驗對比各組試驗數據可知，各試驗組pH值與NH3-N濃度呈先下降后上升，BCP含量與原蟲數量呈先上升后下降，產氣量呈一直上升的趨勢，與劉凱玉等的結果相一致[21]。這可能是在發酵初期微生物以增殖代謝為主，微生物的數量增加，增強了對培養液中的NH3-N利用，降低培養液中NH3-N濃度。因原蟲以吞噬細菌獲得自生營養物質，所以細菌數量的提高，也促進了原蟲數量的增殖。在發酵后期，微生物活性逐漸下降，可能以分解代謝為主，對NH3-N的利用減少，所以NH3-N濃度逐漸上升，BCP含量逐漸下降，導致pH值升高，原蟲數量下降。

本試驗結果得出，各處理組的pH值在5.73～6.72之間，NH3-N濃度在11.61～35.57 mg/100 ml之間，盡管均在正常范圍之內，但添加黑沙蒿可減緩發酵3 h后體外培養液中pH值的降低趨勢，并降低了NH3-N的濃度，其中以添加3%與4.5%效果較顯著；BCP的結果正好呈相反變化。這說明添加黑沙蒿可增強發酵初期的微生物對NH3-N的利用，增加BCP的濃度。添加黑沙蒿可提高發酵6～24 h后的pH值、NH3-N濃度、BCP含量及產氣量，降低了原蟲的數量，并綜合多項指標以添加3%的試驗3組效果較好。有研究指出添加蒿屬植物可抑制纖毛蟲的增殖[22]，因此本試驗可能是由于黑沙蒿的添加，抑制了原蟲的繁殖，減輕原蟲與細菌之間的拮抗作用，促進細菌增殖，提高細菌蛋白及總微生物蛋白產量[23]。微生物數量的增加，提高了分解代謝產生的揮發氣體，進而增加了產氣量。本試驗結果為黑沙蒿在絨山羊生產中的合理使用提供了理論依據，但其作用機理需要進一步探討。

4 結論

①添加黑沙蒿可抑制原蟲的繁殖，降低體外發酵發酵液中的原蟲數量；促進微生物活性，提高體外發酵液中BCP的含量；在發酵后期可提高NH3-N含量，增強絨山羊體外瘤胃的發酵功能。

②綜合各指標，通過添加黑沙蒿對體外各時間點瘤胃發酵參數的影響，在各處理組中，以試驗3組（3%）的添加水平對體外發酵的促進效果最佳。