復合菌種固態發酵法提高甜高粱秸稈飼料品質的研究

■岳 麗 王 卉 山其米克 茆 軍 涂振東

(新疆農業科學院生物質能源研究所，新疆烏魯木齊830091)

甜高粱是一種多用途飼料作物，具有耐旱、耐 澇、耐鹽堿、耐瘠薄等優良特性[1-2]。甜高粱的籽粒和莖稈都可用于生產燃料乙醇，因此被視為最有希望的能源作物[3]。甜高粱秸稈制備乙醇后的剩余殘渣中仍含有部分脂肪、蛋白質、粗纖維等碳水化合物，可用于制作飼料[4]。甜高粱莖稈殘渣的主要成分為木質纖維素，其結構復雜，難于分解[5]。添加纖維素酶可降解部分纖維素，但是纖維素酶生產成本高，不適合大規模使用[6]，通過菌株自身酶系來降解木質纖維素是降低發酵成本的重要手段之一[7]。目前多采用霉菌作為降解纖維菌種，如綠色木霉、康寧木霉、黑曲霉、青霉等[8]。研究表明，利用單菌或單酶對未經處理的木質纖維素進行降解十分困難[9]。因此，如果要充分降解纖維素，需考慮多種微生物之間的協同作用。焦有宙等研究了一種高效的玉米秸稈降解復合菌，發酵后半纖維素的降解率最高達到48.53%，纖維素的降解率為 36.38%，木質素的降解率為40.11%[10]。李明軒以稻草為底物，利用康氏木霉、白腐菌、酵母菌混菌發酵，發酵最終產物中粗蛋白含量從3.49%增加到16.59%，粗纖維含量從44.56%下降到23.17%[11]。通過微生物發酵的手段將甜高粱秸稈轉變成蛋白飼料，不僅節約資源，還有利于農牧業的可持續發展。但由于微生物間存在著協同、拮抗等復雜的關系，因此目前研究的重點是不同種屬菌種間的配伍能否發揮正協同作用[12]。本研究以甜高粱秸稈酒糟為主要原料，以黑曲霉等菌種為發酵菌種，以提高甜高粱秸稈發酵飼料中粗蛋白質含量，降低粗纖維含量為目標，探索單一菌種及雙菌組合對甜高粱秸稈發酵飼料中各物質含量的影響，為發酵甜高粱秸稈生產蛋白飼料提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗菌種與培養基：新高粱3號酒糟，為新高粱3號秸稈發酵蒸餾乙醇后殘渣；麩皮購于北園春市場。白地霉(B)、康寧木霉(K)、產朊假絲酵母(R)購于中國工業微生物菌種保藏管理中心；黑曲霉(H)、枯草芽孢桿菌(C)為本所在實驗室保存。供試菌種所用培養基及主要作用見表1。

表1 供試菌種所用培養基及主要作用

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化

用無菌吸管吸取0.5 ml的液體培養基于安瓿管中將干燥菌體全部溶解，吸出至含有 4～5 ml液體培養基的試管中，白地霉用麥芽汁培養基，培養3～5 d。康寧木霉用馬鈴薯培養基，培養5～7 d。枯草芽孢桿菌用牛肉膏蛋白胨培養基，培養2 d。

1.2.2 液體菌種制備

將100 ml液體培養基裝入500 ml三角瓶中，接入活化的菌種兩環，28℃、120 r/min水浴搖床培養24 h備用。

1.2.3 固態發酵培養

稱取100 g甜高粱秸稈酒糟裝入三角瓶中，121℃滅菌20 min后，按試驗設計，以發酵培養基重的10%（V/W）接入菌種，滅菌后28℃培養72 h，經65℃烘干、粉碎后供分析測定用。

1.2.4 菌種組合發酵試驗設計

雙菌（接種比例1∶1）混合發酵，見表2，每個組合設3個重復。

表2 雙菌組合發酵試驗設計

1.3 測定方法

1.3.1 粗蛋白質含量的測定

參照GB 5009.5—2010凱氏定氮法測定粗蛋白質含量。

1.3.2 粗纖維含量測定

參照國標GB/T6434—94酸堿洗滌法測定粗纖維含量。

1.4 單菌種發酵

選取5株菌種，在無菌操作的條件下，向發酵基質中按10%（v/w）接種量接入菌種菌懸液，充分攪拌混勻后，(30±1)℃的條件下，發酵 3 d后，在60℃條件下將發酵產物烘干、粉碎，測定其中的蛋白質含量和粗纖維含量。每個處理做3次重復，對照試驗為未接菌的甜高粱秸稈酒糟。

1.5 雙菌種發酵

依據單菌發酵試驗的結果，篩選出4株菌種，將這4株菌種兩兩組合進行混菌發酵試驗，菌種配比為1∶1，從而確定出適宜的雙菌組合配伍，其余操作同1.4節。

2 結果

2.1 單一菌種發酵試驗

不同菌種對發酵基質的分解利用程度不同。根據不同菌種發酵后產物中粗蛋白質及粗纖維含量，從而篩選出分解利用甜高粱秸稈基質較好的菌種，結果如圖1所示。

圖1 不同菌種對發酵產物品質的影響

由圖1a可看出，與未接菌的甜高粱秸稈酒糟相比較，白地霉、黑曲霉和產朊假絲酵母發酵產物中的蛋白質含量顯著性增加（P＜0.05），增加幅度可達75.32%、65.11%和37.11%，而且增加幅度比其余2株菌株大，這是由于黑曲霉在生長和繁殖的過程當中，會分泌出纖維素酶、果膠酶以及淀粉酶等[13]，這些酶類可以降解甜高粱秸稈發酵基質中的纖維素等，將其轉化為小分子的單糖，為微生物生長提供所需的營養物質，促進發酵產物中菌體蛋白積累；而白地霉和產朊假絲酵母的發酵產物中的粗蛋白質含量也顯著性升高（P＜0.05），其含量可分別達18.94%、14.81%，這是由于其自身菌體具有較高的蛋白質含量[14]。

由圖1b可以看出，產朊假絲酵母、黑曲霉、康寧木霉、白地霉、枯草芽孢桿菌的發酵產物中粗纖維含量較空白組差異顯著(P＜0.05)，且康寧木霉、枯草芽孢桿菌降低粗纖維幅度較大，分別降低了36.9%、30.98%，這是因為康寧木霉會分泌一些纖維素酶和半纖維素酶，分解了部分纖維素[15]。

2.1.1 發酵時間對黑曲霉發酵酒糟品質的影響

圖2 發酵時間對黑曲霉發酵酒糟品質的影響

從圖2可看出，在發酵時間1～9 d內，隨著發酵時間的延長，粗纖維含量呈下降趨勢，在9 d時達到最低值34.24%；蛋白質含量呈先降低后升高再降低的趨勢，發酵時間為7 d時，蛋白質含量達到最高，平均值可達到19.69%。與發酵7 d相比，發酵9 d時蛋白質含量顯著降低(P＜0.05)，這可能是由于部分蛋白質分解造成的。綜合考慮蛋白質含量和粗纖維含量，發酵時間為7 d時品質較好。

2.1.2 發酵時間對白地霉發酵酒糟品質的影響

由圖3可以看出，隨著發酵時間的增加，白地霉發酵秸稈酒糟殘渣中蛋白質含量顯著升高（P＜0.05），這可能是由于白地霉利用發酵基質中的營養成分增殖菌體引起的[16]。粗纖維含量隨發酵時間的延長而逐漸減少，這可能是由于白地霉可以合成纖維素酶，降解部分纖維素，引起產物中粗纖維含量逐漸降低。

圖3 發酵時間對白地霉發酵酒糟品質的影響

2.1.3 發酵時間對產朊假絲酵母酒糟品質的影響

由不同發酵時間發酵產物中粗纖維含量和蛋白質含量變化曲線（見圖4）可以看出：產朊假絲酵母的發酵產物中蛋白質含量在7 d時達到高峰12.73%，隨后逐漸下降，可推斷產朊假絲酵母在7 d時蛋白酶活力最大。粗纖維含量隨發酵時間的延長而逐漸減少。

圖4 發酵時間對產朊假絲酵母發酵酒糟品質的影響

2.1.4 發酵時間對枯草芽孢桿菌酒糟品質的影響

從圖5可以看出，枯草芽孢桿菌發酵9 d后粗纖維降解率明顯高于3 d。從曲線也看出，枯草芽孢桿菌發酵處理第7 d至第9 d時蛋白質含量急劇增加，從14.84%增加到16.59%，相對增加了11.7%。粗纖維含量隨發酵時間的延長而逐漸減少。

圖5 發酵時間對枯草芽孢桿菌發酵酒糟品質的影響

2.1.5 發酵時間對康寧木霉酒糟品質的影響

從不同發酵時間產物中蛋白質含量及粗纖維含量的變化情況可以看出(見圖6)，經康寧木霉發酵后的甜高粱秸稈酒糟，蛋白質含量呈先升高后下降的趨勢，第7 d時蛋白質含量最高。從發酵第3 d到第9 d，康寧木霉處理后秸稈酒糟中的粗纖維含量呈直線下降趨勢。

圖6 發酵時間對康寧木霉發酵酒糟品質的影響

2.2 雙菌組合發酵結果

將不同的微生物進行組合后，不同的組合利用甜高粱秸稈基質的效果將會產生差別，因為它們的互作機制不同，從而導致協同關系有差異[17-18]，所以需要測定不同的雙菌組合發酵秸稈酒糟中蛋白質含量和粗纖維含量，從而篩選出最優組合，結果如圖7所示。

圖7 雙菌組合對發酵產物品質的影響

由圖7可看出，與空白組相比，6個雙菌組合的秸稈酒糟發酵產物中粗蛋白質含量均顯著性升高（P＜0.05），粗纖維含量顯著性降低（P＜0.05），同時，與相對應的單一菌種發酵產物相比較，雙菌組合發酵秸稈酒糟中的粗蛋白質含量均比之高，粗纖維含量均比之低。6種菌種組合中，白地霉和產朊假絲酵母組合，蛋白質含量增加幅度最大，與空白組相比增加了19.43%，但是此組合粗纖維含量高達38.95%。黑曲霉和產朊假絲酵母組合發酵產物中蛋白質含量為18.79%，與白地霉和產朊假絲酵母組合相比，無顯著性差異（P＞0.05）；粗纖維含量為34.68%，較未接菌降低了16.38%，且較單一菌種黑曲霉和產朊假絲酵母分別降低了8.15%、7.01%；綜合考慮發酵后甜高粱秸稈酒糟中的蛋白質含量和粗纖維含量，黑曲霉和產朊假絲酵母組合協同共生關系最優。

3 討論

將酵母菌與木霉、黑曲霉或白地霉進行混菌發酵時，雙菌組合的粗蛋白含量均高于相應單一菌種。這可能是由于混菌之間可以形成良好的協同共生關系[19-20]，且對合成蛋白酶和纖維素酶的過程具有一定的反饋調節作用，大大增加蛋白酶和纖維素酶的活力[21-22]。同時，分泌的纖維素酶可促進甜高粱秸稈基質中纖維素分解為單糖，促進菌種生長繁殖，增加菌體蛋白，從而提高發酵秸稈酒糟中粗蛋白質含量，降低纖維素含量。

4 結論

①在單一菌種發酵試驗中，得出可用于提高發酵高粱秸稈酒糟蛋白質含量的優良菌種為白地霉，分解粗纖維的優勢菌種為康寧木霉。

②在雙菌組合發酵試驗中，綜合考慮蛋白質含量和粗纖維含量，可得出黑曲霉和產朊假絲酵母是用于發酵甜高粱秸稈酒糟蛋白飼料的優選組合，發酵7 d后，粗蛋白質含量可達18.79%，粗纖維含量34.68%。