化學(xué)發(fā)光免疫檢測在甲胎蛋白檢驗(yàn)中的應(yīng)用準(zhǔn)確性評價(jià)及其性能分析

張學(xué)棟 趙 潔 潘有龍

血清甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)是人體在胚胎時(shí)期血液中含有的一種特殊蛋白，胎兒出生后，血清AFP濃度逐漸下降，數(shù)月至1年內(nèi)降至正常水平，故一般正常人血清中AFP含量極微[1]。當(dāng)人體患有各種惡性腫瘤疾病，如胚胎癌、卵巢癌和極少數(shù)胃、胰、膽管以及結(jié)腸直腸癌時(shí)，血清AFP含量可顯著升高，但其絕對值均不如肝細(xì)胞癌[2]。目前，多項(xiàng)臨床研究證實(shí)，血清AFP對肝細(xì)胞癌有特異診斷價(jià)值，尤其是動態(tài)變化測定，如AFP連續(xù)4周陽性，同時(shí)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransfease，ALT)正常，并且排除以上疾病，可以明確診斷為肝癌，其陽性率可達(dá)60%～80%，可見，血清AFP檢測對早期肝癌診斷的重要意義[3]。

近年來，隨著各種檢測方法學(xué)的不斷發(fā)展和完善，時(shí)間分辨熒光免疫分析(time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)法和化學(xué)發(fā)光免疫分析(chemiluminescence immunoassay，CLIA)法在國內(nèi)的普及程度越來越廣，被認(rèn)為是測定血清AFP最準(zhǔn)確的兩種方法[4]。為探討TRFIA和CLIA在血清AFP檢測中應(yīng)用準(zhǔn)確性，本研究將收治的40例肝癌患者和接受正常體檢的30名健康人作為研究對象，分別采用以上兩種方法測定所有者血清AFP含量，并對測定結(jié)果及其性能進(jìn)行分析總結(jié)，以期為后續(xù)研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究資料

選取2017年3月至2018年3月青海省心腦血管病?？漆t(yī)院收治的40例肝癌患者，將其納入肝癌組，同期選取接受正常體檢的30名健康體檢者，并將其納入健康組。肝癌組中男性21例，女性19例；年齡29～71歲，平均年齡(59.33±5.72)歲；所有肝癌患者均符合中國抗癌協(xié)會肝癌專業(yè)委員會頒布的《原發(fā)性肝癌診斷標(biāo)準(zhǔn)》[5]。健康組中男性15名，女性15名；年齡30～72歲，平均年齡(58.89±5.90)歲。兩組一般資料比較無差異，具有可比性。所有入組者及家屬均知情同意，且簽署知情同意書，本研究獲得醫(yī)院倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

(1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①入組者及家屬了解研究內(nèi)容，同意參與并簽署知情同意書；②無腎臟、心臟、肺等其他實(shí)質(zhì)性臟器功能異常；③無免疫功能、凝血功能異常；④未伴有其他嚴(yán)重傳染性、血液性及惡性腫瘤疾病。

(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有嚴(yán)重急慢性疾病和傳染性疾?。虎诎橛衅渌麌?yán)重惡性腫瘤疾?。虎劬裾系K或智力障礙。

1.3 儀器和試劑

TRFIA法采用ANYTEST2000型時(shí)間分辨熒光測定儀及相關(guān)配套試劑(上海新波生物技術(shù)公司)。CLIA法選用Centaur XP型化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(德國西門子公司)，相關(guān)配套試劑均購自同一儀器公司。

1.4 檢測方法

(1)樣本采集。取兩組入組者清晨空腹靜脈血5 ml，常規(guī)以3000 r/min離心15 min后取上層血清，置于-70 ℃的冷凍箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)測定操作。CLIA法和TRFIA法同時(shí)進(jìn)行，TRFIA法共測定兩次取平均值，CLIA法只需測定一次，記錄檢測結(jié)果。同時(shí)取高、中、低3種濃度的AFP標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)由兩種方法進(jìn)行檢測，記錄檢測結(jié)果并計(jì)算變異系數(shù)(coefficient variation，CV)值和重復(fù)性。將AFP高表達(dá)(250 ng/ml)的標(biāo)準(zhǔn)品血清溶于正常人健康血清中，比例為1∶1，另將肝癌組患者血清樣本與生理鹽水混合稀釋，再加入AFP高表達(dá)(250 ng/ml)的標(biāo)準(zhǔn)品血清，比例同樣為1∶1，再次經(jīng)由兩種方法測定AFP值，并計(jì)算回收率。所有檢測流程嚴(yán)格按照儀器試劑使用說明書進(jìn)行。

1.5 觀察指標(biāo)

觀察兩種不同檢測方法測定肝癌患者和健康人血清中AFP含量結(jié)果，并比較其準(zhǔn)確性；觀察兩種方法檢測不同濃度AFP標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)果，并對比其CV值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，采用x2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清AFP測定結(jié)果比較

TRFIA法和CLIA法測定肝癌組與健康組血清樣本中AFP含量比較顯示，肝癌組血清樣本中AFP表達(dá)量均顯著高于健康組，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=28.300，t=28.516；P＜0.05)；兩組TRFIA法與CLIA法測定結(jié)果比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.039，t=0.054；P＞0.05)，見表1。

表1 兩組患者血清AFP測定結(jié)果比較(ng/ml，±s)

表1 兩組患者血清AFP測定結(jié)果比較(ng/ml，±s)

注：表中TRFIA為時(shí)間分辨熒光免疫分析；CLIA為化學(xué)發(fā)光免疫分析。

組別 例數(shù) 檢測方法 t值 P值TRFIA CLIA肝癌組 40 552.20±105.41 553.18±104.790.039 0.969健康組 30 6.39±3.11 6.43±3.06 0.054 0.957 t值 28.300 28.516 - -P值 0.000 0.000 - -

2.2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果比較

(1)TRFIA和CLIA兩種檢測方法測定高濃度AFP標(biāo)準(zhǔn)品血清中AFP含量明顯高于中、低濃度AFP標(biāo)準(zhǔn)品血清，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=29.330，t=31.114；P＜0.05)，見表2。

表2 兩種方法檢測不同濃度血清樣本中AFP含量比較(ng/ml，±s)

表2 兩種方法檢測不同濃度血清樣本中AFP含量比較(ng/ml，±s)

注：①表中TRFIA為時(shí)間分辨熒光免疫分析法，CLIA為化學(xué)發(fā)光免疫分析法；②與TRFIA比較，*P＞0.05。

AFP測試 檢測方法CLIA TRFIA高濃度500 500.23±9.28 500.41±18.20中濃度100 100.30±8.77 100.55±8.46低濃度10 10.28±2.46 10.30±2.11 t值 29.330 31.114 P值 0.000 0.000

(2)TRFIA和CLIA兩種檢測方法測定高濃度AFP標(biāo)準(zhǔn)品血清中CV值明顯低于中、低濃度AFP標(biāo)準(zhǔn)品血清，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=8.501，x2=7.978；P＜0.05)；TRFIA與CLIA測定結(jié)果比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=0.521，P＞0.05)，見表3。

表3 兩種方法檢測不同濃度血清樣本CV值比較(%)

2.3 回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

CLIA法測定肝癌組AFP回收量為(248.66±5.18)ng/ml，健康組為(247.79±5.20) ng/ml，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.694，P＞0.05)；肝癌組回收率為98.96%，健康組為98.77%，兩組比較其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=0.016，P＞0.05)。

3 討論

AFP是近年來臨床應(yīng)用較為廣泛的一種腫瘤標(biāo)志物，對肝細(xì)胞癌或其他多種惡性腫瘤疾病的早期診斷、鑒別、流行病學(xué)調(diào)查和理論研究都有較高的應(yīng)用價(jià)值[6]。有研究顯示，AFP重新升高對肝細(xì)胞癌的診斷陽性符合率為70%～90%。AFP動態(tài)變化還與病情有一定關(guān)系，AFP高患者預(yù)后往往欠佳，手術(shù)切除后2個(gè)月AFP應(yīng)降至正常，不降或降而復(fù)升提示手術(shù)效果欠佳或復(fù)發(fā)，同時(shí)還能作為肝癌患者放化療效果的評價(jià)指標(biāo)[7]。

目前臨床常用的檢測AFP的方法包括放射免疫測定(radioimmunoassay，RIA)、酶免疫測定(enzyme immunoassay，EIA)和免疫放射分析(immunoradiometric assay，IRMA)法等分析技術(shù)。隨著近年來科學(xué)技術(shù)和臨床醫(yī)療水平不斷發(fā)展，TRFIA法和CLIA法已逐漸在固相標(biāo)記免疫技術(shù)中處于領(lǐng)先地位，其檢驗(yàn)準(zhǔn)確性也得到廣大醫(yī)務(wù)工作者的認(rèn)可[8]。TRFIA法是近10年發(fā)展起來的一種非同位素免疫分析技術(shù)，是當(dāng)前最靈敏的微量分析技術(shù)。TRFIA法主要應(yīng)用鑭系元素標(biāo)記抗原或抗體，根據(jù)鑭系元素螯合物的發(fā)光特點(diǎn)，用時(shí)間分辨技術(shù)測量熒光，同時(shí)檢測波長和時(shí)間兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行信號分辨，可有效地排除非特異熒光的干擾，極大地提高了分析靈敏度，具有特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、檢測范圍廣、試劑壽命長、操作簡便和非放射性等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于微量元素分析中[9-10]。近年來有學(xué)者研究指出，TRFIA法在血清AFP含量檢驗(yàn)中敏感度不高，應(yīng)用效果并不理想。為此，本研究在分別應(yīng)用TRFIA法和CLIA法檢測所有血清樣本，目的即探討兩種檢驗(yàn)方法在測定血清AFP中的應(yīng)用價(jià)值[11-12]。

本研究結(jié)果顯示，肝癌組患者和健康人血清AFP含量差異顯著，在TRFIA法和CLIA法檢測結(jié)果中均得以體現(xiàn)，但對比發(fā)現(xiàn)，肝癌患者或健康人血清AFP含量TRFIA法和CLIA法測定結(jié)果比較均無明顯差異；重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，TRFIA法和CLIA法在測定不同濃度AFP標(biāo)準(zhǔn)品血清中精確度較高，故TRFIA法和CLIA法在測定人血清AFP表達(dá)量中均能獲得較高的敏感度。CLIA法是近年來研發(fā)的一種新型檢驗(yàn)技術(shù)，標(biāo)記免疫方法較為新穎，加之化學(xué)發(fā)光和免疫測定相結(jié)合，具有檢測速度快、測定準(zhǔn)確率高、測定范圍廣以及自動化程度高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于多種臨床檢驗(yàn)工作中[13-14]。龔信建等[15]應(yīng)用電化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測消化道腫瘤5項(xiàng)標(biāo)志物，其結(jié)果顯示，原發(fā)性肝癌患者中AFP含量明顯高于正常水平，單項(xiàng)檢測敏感度、特異度和診斷準(zhǔn)確率較高。

4 結(jié)語

CLIA法應(yīng)用于多種消化道腫瘤標(biāo)志物檢測中均能取得較高的準(zhǔn)確率，雖然研究方法有一定差異，但多項(xiàng)研究均可證實(shí)CLIA法在血清AFP檢測中的應(yīng)用價(jià)值。TRFIA和CLIA兩種方法應(yīng)用于血清AFP檢驗(yàn)中，均能取得較高的準(zhǔn)確性，臨床應(yīng)用時(shí)可根據(jù)實(shí)際情況選擇檢驗(yàn)方法。