60Coγ射線全身照射后大鼠血漿中*GDF-15、Flt-3L和SAA表達的劑量相關性研究

孫佳麗 李 爽 田 梅 劉青杰*

輻射損傷的早期生物標志物對核事故或者核恐怖襲擊中受照人群進行分類和治療至關重要。研究表明，有些蛋白質可以作為候選的輻射生物標志物，輔助估算輻射暴露劑量[1-2]。Fms樣酪氨酸激酶3配體(Fms-like tyrosine kinase 3 ligand，Flt-3L)和血清淀粉樣蛋白A(serum amyloid a protein，SAA)在輻照后的小鼠和非人靈長類的血漿中表達增高，有研究將其作為輻射敏感候選生物標志物[3-4]。然而，Flt-3L和SAA在輻照后大鼠血漿中的表達情況尚不清楚。Flt-3L蛋白是一種內源性小分子，可以通過激活造血祖細胞增加免疫細胞(B細胞和T細胞)的數量；還可以動員體內造血祖細胞和干細胞，這可能有助于機體殺死癌細胞[5]。SAA是在炎癥的急性期分泌，具有多種功能，包括將免疫細胞募集到炎癥部位，以及誘導酶降解細胞外基質等[6]。

生長分化因子-15(growth differentiation factor-15，GDF-15)屬于轉化生長因子β超家族的一種蛋白質，在心血管疾病中觀察到GDF-15蛋白有調節細胞凋亡、細胞修復和細胞生長的作用[7]。在前期研究中，利用基因芯片技術篩選輻射差異表達基因，其中GDF-15基因是所有基因中受電離輻射誘導后表達變化最為顯著的基因[8]。通過γ射線和锎252(252Cf)中子源照射人永生化淋巴細胞株，發現其蛋白質表達水平也呈現出良好的劑量效應關系[9]。但是，細胞株輻照后的變化不能反應全身照射后的電離輻射引起的改變，有必要研究全身照射后血漿GDF-15蛋白的表達情況。因此，本研究通過分析大鼠全身照射后Flt-3L、SAA和GDF-15蛋白在血漿中的表達情況，為進一步探究作為大鼠全身照射的輻射敏感蛋白可能性提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

選取無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級(Sprague Dawley， SD)大鼠72只，雄性，8周，體重(230±10)g，購自北京大學醫學部實驗動物科學部，生產許可證號：SYXK(京)2016-0010)，在北京大學醫學部實驗動物科學部飼養，屏障環境使用許可證：SYXK(京)2016-0041)。飼養條件的溫度為(22±2)℃，相對濕度為40%～60%，噪聲dB聲濕度。實驗前將大鼠按標準采食量飼喂并自由飲水1周，觀察大鼠的生長狀態，將生長健康的大鼠納入研究。將72只健康SD大鼠按照照射劑量分為0 Gy組、1 Gy組、3 Gy組和5 Gy組，每組18只，每6只飼養在同一籠里。本研究的實驗方案經過中國疾病預防控制中心輻射安全所實驗動物倫理福利委員會審查批準。

1.2 材料與儀器

(1)材料。Flt-3L酶鏈免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒和SAA ELISA檢測試劑盒，購于武漢華美生物工程有限公司；GDF-15 ELISA檢測試劑盒，購于美國R&D公司。

(2)儀器。MR23i低溫冷凍離心機(美國Thermo Scientific)；Thermo Labsystems MK3酶標儀(美國Thermo Scientific)。

1.3 照射方法

采用60Co γ射線照射大鼠，60Co γ射線輻照源由北京市輻照中心提供，源強130 TBq，源靶距84 cm，照射視野面積30 cm×30 cm，單次全身照射，劑量率為1 Gy/min，每組劑量分別為0 Gy、1 Gy、3 Gy和5 Gy。

1.4 樣品采集及處理

經60Co γ射線照射1 d、3 d和5 d后，通過大鼠眼眶內眥靜脈采血，采集的血液存放在EDTA抗凝負壓管中，30 min內離心，4 ℃，3000 r/min，離心10 min，取上清，分離的血漿分裝后凍存于-80 ℃冰箱備用。

1.5 血漿蛋白ELISA檢測方法

將各種試劑移至室溫平衡30 min備用；分別向標準孔、待測樣品孔中加樣100 μl，輕輕晃動后于37 ℃溫育2 h；棄去液體甩干，不洗滌；每孔加入生物素標記抗體工作液100 μl，于37 ℃溫育1 h；棄去液體甩干，洗板3次，每次每孔200μl洗滌液，每次2 min，甩干；每孔加入辣根過氧化物酶標記親和素工作液100 μl，于37 ℃溫育1 h；棄去液體甩干，洗板5次，每次每孔200μl洗滌液，每次2 min，甩干；每孔加入底物溶液90μl，于37 ℃避光顯色15～30 min后，每孔加入終止溶液50μl，終止反應。終止后5 min內用酶標儀450 nm波長測量各孔的光密度(OD值)。

1.6 數據分析

ELISA數據采用標準品及樣品值減去S0孔數值(S0孔是標準孔中只加稀釋液，未加標準蛋白的校正孔)，復孔取其平均值后，繪制曲線。以標準品的濃度為縱坐標，OD值為橫坐標，利用專業制作曲線的軟件“Curve Expert”進行繪圖并計算出樣本濃度。

1.7 統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析。數據以均值±標準差(±s)表示。多個樣本均數間比較經過正態性和方差齊性檢驗，采用單因素方差分析(oneway， ANOVA)；若方差分析組間效應有統計學意義時，表示至少有兩組的總體均數不同，采用LSD-t檢驗(least significance difference test)進一步分析組與組之間的差別。采用線性回歸方法建立劑量-效應方程，ANOVA分析劑量-反應曲線方程的意義，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗動物的一般狀態

照射后大鼠進食與飲水情況良好，無死亡，未觀察到明顯的脫毛嘔吐現象。照射后1 d和3 d，1 Gy組、3 Gy組和5 Gy組的大鼠體重與0 Gy組相比，體重明顯降低且差異有統計學意義(t=6.20，t=2.34，t=8.05，t=5.09，t=5.34，t=9.59；P＜0.05)，見表1；照射后5 d，3 Gy組和5 Gy組與0 Gy組比較，大鼠體重降低且差異有統計學意義(t=2.74，t=10.06；P＜0.05)。5 Gy劑量組大鼠的體重，隨著照射后時間的延長，體重并未升高，1 Gy組和3 Gy組大鼠的體重，隨著飼養時間的延長體重有不同程度的增長。

表1 SD大鼠不同時間全身照射前后體重的變化(±s)

表1 SD大鼠不同時間全身照射前后體重的變化(±s)

不同時間照射后體重(g)1 d t值 P值 3 d t值 P值 5 d t值 P值0 Gy組 6 230.2±8.84 281.2±5.08 - - 301.0±2.61 - - 305.3±11.54 - - 1 Gy組 6 230.2±10.26 242.6±9.33 6.20 ＜0.05 258.8±12.52 5.09 ＜0.05 296.0±4.00 0.17 ＞0.05 3 Gy組 6 229.7±9.16 240.4±8.69 2.34 ＜0.05 259.2±10.40 5.34 ＜0.05 276.6±14.28 2.74 ＜0.05 5 Gy組 6 231.3±8.86 228.0±11.34 8.05 ＜0.05 226.0±14.79 9.59 ＜0.05 221.0±7.09 10.06 ＜0.05組別 樣本數(只)照射前1周體重(g)

2.2 GDF-15蛋白表達變化

在每個觀察時間點，血漿中GDF-15蛋白的表達量隨著照射劑量的增加而明顯升高。各劑量組與0 Gy組比較，其GDF-15蛋白均在照后1 d達到最高值，1 Gy組血漿GDF-15蛋白濃度為(313.71±19.08)pg/ml，3 Gy組為(672.75±133.33)pg/ml，5 Gy組為(1402.54±526.08)pg/ml。照后1 d，1 Gy組血漿中GDF-15蛋白表達升高4倍，3 Gy組升高9倍，5 Gy組升高18倍；照后3 d和5 d，3 Gy組和5 Gy組的GDF-15蛋白表達量與0 Gy組相比，表達增高且差異有統計學意義(t=3.09，t=6.32，t=8.91，t=10.71，t=2.73，t=6.64，P＜0.05)。各劑量組中，同一劑量點GDF-15蛋白的表達量均在照射后1d達到最高值，隨著照射后時間的延長表達量降低，如圖1所示。

圖1 60Co γ射線全身照射后SD大鼠不同時間點血漿中GDF-15蛋白的表達變化示圖

照射后1 d、3 d和5 d，大鼠血漿中的GDF-15蛋白表達量與照射劑量之間呈現出良好的劑量-效應關系，擬合直線方程的R2≥0.887，見表2。

表2 60Co γ射線全身照射后SD大鼠血漿GDF-15蛋白表達水平的劑量-效應關系

2.3 Flt-3L蛋白表達變化

大鼠血漿Flt-3L的表達量在照射后1 d、3 d和5 d，有隨劑量升高而升高的趨勢，照射后5 d的劑量-效應趨勢最好。在照射后1 d、3 d和5 d，與0 Gy組比較，5 Gy組血漿中Flt-3L的表達量均明顯升高，差異有統計學意義(t=4.22，t=8.48，t=5.51；P＜0.05)；3 Gy組只在照后1 d和5 d表達增高，差異有統計學意義(t=5.79，t=3.69；P＜0.05)。在照射后3 d，1 Gy組和5 Gy組照射的大鼠血漿Flt-3L的表達量達到最高值，1 Gy組達到(161.34±28.47)pg/ml，5 Gy組為(239.04±51.49)pg/ml。3 Gy組照射后Flt-3L的表達量在照后1 d達到最高值，濃度為(198.96±26.22)pg/ml。各劑量組在照射后隨著飼養時間的延長，血漿中Flt-3L的表達呈波動變化，如圖2所示。

圖2 60Co γ射線全身照射后SD大鼠不同時間點血漿中Flt-3L蛋白的表達變化示圖

照射后3 d和5 d，大鼠血漿中的Flt-3L蛋白表達量與照射劑量之間呈現出了良好的劑量-效應關系，擬合直線方程的R2≥0.861，見表3。

表3 60Co γ射線全身照射后SD大鼠血漿Flt-3L表達水平的劑量-效應關系

2.4 SAA蛋白表達變化

在照射后1 d、3 d和5 d，大鼠血漿中SAA的表達量隨著照射劑量升高變化趨勢不同，只有照射后1 d，有隨著照射劑量升高SAA表達量增加的趨勢。照射后1 d和3 d，5 Gy組SAA的表達量與0 Gy組比較表達升高，差異有統計學意義(t=2.53，t=2.28；P＜0.05)；照射后5 d各劑量組與0 Gy組比較，SAA的表達量的差異均無統計學意義(F=2.71，P＞0.05)，如圖3所示。

圖3 60Co γ射線全身照射后SD大鼠不同時間點血漿中SAA蛋白的表達變化示圖

3 討論

有研究表明，小鼠在照射后會出現體重等身體機能指標的變化。本研究發現照射后SD大鼠出現了體重下降或者體重增長變緩的情況。Ossetrova等[3]研究發現，小鼠在照射1～3 Gy和6～8 Gy時，均是在照射后3 d體重下降最明顯。本研究中大鼠在照后1 d與0 Gy組相比，其他3組體重有明顯的下降，可能是暴露于照射因素以及運輸中的不良環境等綜合因素導致；照后3 d、5 d，1 Gy組和3 Gy組大鼠體重都有增長，5 Gy組大鼠體重未見增長，表明照射對大鼠的生長造成了一定影響。

GDF-15基因是TGF-1家族的一個成員，可以被IL-1、IL-2和TNF-9等細胞因子激活，最早在巨噬細胞中被發現[4]。是DNA損傷信號傳導的重要下游介導物[10]。多種化學應激和環境因子誘導GDF-15表達升高，提示GDF-15在細胞穩態中起著關鍵作用[11]。Sándor等[12]研究發現，GDF-15蛋白在輻照后人成纖維細胞中表達升高，可能成為輻射誘導細胞的早期生物標志物。本實驗室研究也證實GDF-15蛋白在照射后人永生化淋巴細胞株中表達增高，并具有良好的劑量-效應關系[9]。本研究中GDF-15蛋白在大鼠照后1 d血漿中的量效關系最好，這與其在照射后的人永生化淋巴細胞株中的表達情況相同，不同點在于兩個研究中GDF-15蛋白表達量上的差別，如照后1 d的人永生化淋巴細胞株中GDF-15蛋白在5 Gy組的表達量是0 Gy組的2倍，在相同條件下，全身照射5 Gy組的大鼠血漿中GDF-15蛋白表達量是0 Gy組的18倍。

Flt-3L是調節造血系統最重要的細胞因子之一，其作用是刺激各種造血祖細胞的增殖和分化。由于在小鼠和非人靈長類的研究中表現出對骨髓照射的高度特異性，Flt-3L被作為輻射誘導的骨髓再生障礙嚴重程度的生物標志物[13-14]。本研究發現，大鼠血漿中Flt-3L的表達情況和一些研究中小鼠中的表達趨勢相似；Kim等[15]采用X射線照射小鼠、Sproull等[16]和Ostrava等[17]采用γ射線照射小鼠，全身照射劑量在1～6 Gy，照射后1～5 d，小鼠血漿中Flt-3L的表達都隨著受照射劑量的增加表達量升高，而且研究發現小鼠血漿中Flt-3L在照射后2 d和3 d的量效趨勢很好；在非人靈長類的研究中發現，Flt-3L在照射后2 d和7 d的量效趨勢最好[18]。本研究中Flt-3L的表達在照射后各時間點有隨照射劑量增加而升高的趨勢，用Flt-3L擬合劑量-效應曲線，照射后1 d，劑量-效應關系不太理想，照射后3 d和5 d擬合的曲線比較好。

SAA通過刺激細胞因子在肝臟中合成，在炎癥反應中起著重要作用；SAA可在輻射刺激后數日檢測到，其是否發生顯著性變化取決于頭部是否在輻射場中；SAA動態變化水平可以作為反應時間進程和急性放射病嚴重程度的候選指標，并可作為非均勻輻射暴露譜中輻射暴露的生物標志物[19-21]。SAA是急性反應蛋白，輻射等刺激因素出現后，SAA表達會升高。有研究發現，照射后小鼠血漿中SAA在4 h后表達量開始增多，照射后1 d表達量達到頂峰，其中5 Gy組的表達量是基線水平的10倍左右[3，20，22]。然而，本研究中大鼠全身照射5 Gy組的表達量僅為基線水平的1.82倍，推測可能是大鼠血漿中SAA蛋白對輻射敏感度較低。Blakely等[23]在研究X射線照射后的CD2F1小鼠時發現，血漿中SAA的表達量并不表現依賴照射劑量增加而升高。由此可以看出SAA作為輻射敏感蛋白在不同的實驗中表達可能并不穩定。由于本研究的數據有限，關于SAA在大鼠血漿中的表達情況還有待進一步研究。

Flt-3L蛋白在大鼠全身照射后5 d呈現出最好的劑量-效應關系， GDF-15蛋白在大鼠全身照射后1 d呈現出最好的劑量-效應關系。但是，由于本研究樣本數量有限，血漿中Flt-3L和GDF-15蛋白能否作為大鼠全身照射后候選的輻射敏感生物標志物還有待深入探索。