小動物分子影像技術在小鼠輸注儲存紅細胞促進細菌感染監測中的應用

吳 濤 周 俊 陳 震 張秋麗 晉 晶 付秋霞 詹林盛

在應急條件或野戰情況下，創傷后失血增加，是引發傷者死亡的主要原因之一。在創傷失血后的最佳救治時間內，懸浮紅細胞(red blood cells，RBCs)輸注顯得尤為必要和迫切。此外，在創傷后失血常伴隨全身嚴重炎癥，在救治過程中，懸浮RBCs輸注也仍然是一種重要的救治手段。而儲存RBCs的輸注在這種情況下也不可避免，其輸注能促進創傷后炎癥、加重感染，進一步引發膿毒血癥、導致感染性并發癥，是導致患者死亡的獨立危險因素，但其具體作用機制尚不明確[1-3]。因此，要解決儲存RBCs輸注誘導創傷后炎癥及增強感染這一臨床問題，加強其致病機制的研究，必須尋找一種可靠的技術對動物感染模型進行觀察和研究。本研究采用活體熒光成像儀，利用小動物分子影像技術監測小鼠輸注儲存紅細胞對細菌感染的作用過程。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Balb/c小鼠60只，均為雄性，6～8周齡，體質量為18～22 g，購自軍事醫學科學院實驗動物中心，并于無特定病原體(specific pathogen free，SPF)飼養間進行飼養。

在60只小鼠中，進行細菌感染實驗的小鼠分為4組，每組5只；鐵(Fe)及Fe抑制劑小鼠分為4組，每組5只；進行小鼠存活率實驗的小鼠分為2組，每組10只。

1.2 實驗菌株

肺炎克雷伯菌Xen39菌株，大腸桿菌Xen5菌株，銅綠假單胞菌Xen13菌株，均由PerkinElmer公司贈送。

1.3 儀器設備

IVIS 50型活體熒光成像儀(美國Caliper公司)；HEMAVET 950血常規測定儀(美國Mascot公司)；3K15臺式冷凍離心機(德國Sigma公司)；THZ-C型恒溫振蕩器(江蘇太倉實驗設備廠)；PurecellNeo過濾器(美國Pall公司)。

1.4 試劑及材料

右旋糖酐鐵(iron dextran，批號SLBJ6731V)，右旋糖酐(dextran，批號SLBL 9703V)，CPDA抗凝劑(批號SLBK2844V)，血紅蛋白檢測試劑盒(批號BF03A26V)，均來自美國Sigma公司；戊巴比妥鈉(北京化學試劑公司，批號160714)；異氟烷(山東科源制藥有限公司，批號64160301)。

1.5 懸浮RBCs的制備

C57BL/6小鼠注射1%戊巴比妥鈉進行麻醉。通過心臟穿刺，無菌采血到檸檬酸鹽-磷酸鹽-葡萄糖-腺嘌呤(CPDA)-1抗凝劑中。用于儲存的最終CPDA-1濃度為14%。將來自20～40只小鼠的全血混合。使用新生兒白細胞去除過濾器進行全血的白細胞去除。去除白細胞的全血，以3000 r/min離心15 min。去除上層的血漿，并將體積減少至最終的血紅蛋白濃度為16～19 g/dl。將RBCs(約15 ml)置于50 ml的Falcon管中，并在4 ℃下儲存長達14 d。

1.6 實驗方法及觀察指標

1.6.1 RBCs輸血和細菌感染

小鼠分4組，每組5只。用小鼠固定器固定小鼠，用乙醇溶液對鼠尾進行消毒。用注射器吸取準備好的細菌溶液。選擇進針點，注射器針頭穿刺入尾靜脈，向前推進約2～3 mm。通過尾靜脈注射細菌200 μl感染每只實驗小鼠。RBCs懸浮液稀釋調整至血紅蛋白濃度為17.0～17.5 g/dl。將400 μlRBCs懸浮液(相當于2單位的人RBCs)通過異氟烷麻醉小鼠的眼后靜脈叢輸注。注射結束后將小鼠放回籠中繼續飼養。

1.6.2 小動物活體成像

將實驗動物放入氣體麻醉箱中，打開麻醉氣體開關，用1%～3%異氟烷麻醉。待實驗動物停止活動后，將其放入活體成像儀中，打開麻醉氣體開關，并保持1%～2%的異氟烷持續麻醉。根據注射細菌數量不同，選取自動活體成像模式，1～5 min不等，成像結束后，將實驗動物放回動物飼養箱中。

1.6.3 Fe及Fe抑制劑注射

300 mg葡聚糖溶于3 ml的水中，THZ-C恒溫振蕩器振蕩16～18 h。細菌擴大培養，以2%的菌量接種于100 ml培養基中，37 ℃搖床，待其菌液D值為0.5左右。將菌液轉移至50ml滅菌離心管中，4 ℃，4000 r/min離心15 min。棄上清，加入5 ml培養基后，用槍吹打均勻。小鼠氣管插管，注射50 μl肺炎克雷伯菌菌液，存活小鼠分2組，每組5只，第2組注射40 μl右旋糖酐鐵。小鼠于0 h、1 h、4 h、8 h、12 h和24 h用成像儀成像。小鼠分4組，每組5只，第2組、第4組注射40 μl右旋糖酐鐵。第1組、第2組腹腔注射100 μl大腸桿菌菌液，第3組、第4組尾靜脈注射100 μl銅綠假單胞菌菌液。小鼠于0 h、0.5 h、1 h、4 h、4.5 h、5 h、6 h、8 h、12 h和24 h用成像儀成像。

1.6.4 小鼠存活率實驗

將20只小鼠分為2組，每組10只。各組分別通過尾靜脈注射不同濃度的細菌200 μl，感染實驗小鼠。同時通過小鼠的眼后靜脈叢輸注RBCs懸浮液400 μl。注射后24 h觀察每組小鼠的存活數量，計算小鼠存活率。

1.7 統計學方法

所有數據資料采用SPSS 17.0統計學軟件進行統計學分析，定量資料用均數±標準差(±s)表示，兩組數據進行比較時，采用t檢驗。多組間進行比較時若組間方差齊時，采用單因素多水平設計定量資料方差分析(ANOVA)；組間方差不齊時，采用非參數檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 生物發光成像

小動物活體成像的生物發光成像顯示，用儲存RBCs輸注的小鼠中，感染后第1個24 h的生物發光通量的曲線下面積顯著增加(＞50%)。數據表明，輸入儲存的RBCs可以加重膿毒血癥并降低銅綠假單胞菌感染小鼠的存活率(如圖1所示)。

圖1 活體熒光成像監測RBCs輸注對銅綠假單胞菌在小鼠體內增殖狀態的影響示圖

2.2 Fe促進大腸桿菌及銅綠假單胞菌增殖

(1)RBCs代謝過程中會產生大量游離的Fe+，Fe+能夠被細菌攝取，從而促進細菌繁殖，因此，本研究觀察了Fe對大腸桿菌和銅綠假單胞菌繁殖的影響，其研究發現：Fe可以促進大腸桿菌增殖。加Fe的一組細菌在8 h增殖達到峰值，12 h全部死亡(如圖2所示)。

圖2 Fe促進大腸桿菌增殖示圖

(2)Fe可以促進銅綠假單胞菌增殖，4 h開始，兩組有明顯差異(如圖3所示)。

圖3 Fe促進銅綠假單胞菌增殖示圖

2.3 小鼠存活率

研究儲存RBCs輸注對銅綠假單胞菌誘導膿毒血癥的作用，使用2×107cfu的銅綠假單胞菌和400 μl新鮮或儲存RBCs靜脈內注射給小鼠。本研究發現用儲存RBCs輸注小鼠的存活率顯著低于輸注新鮮RBCs小鼠的存活率，差異有統計學意義(t=2.835，P＜0.05)，如圖4所示。

圖4儲存的RBCs輸注降低銅綠假單胞菌感染小鼠的存活率示圖

3 討論

應急及特殊環境下發生感染的創傷患者具有較差的微循環功能和組織氧合能力，器官易于受到損傷，更易引發膿毒血癥，病死率較高。已有研究表明，儲存RBCs的輸注加重革蘭陰性細菌的感染，且游離血紅素在創傷出血中增加儲存RBCs的毒性，誘導急性器官損傷或引起嚴重創傷患者的死亡[4-5]。應急或野戰條件下的創傷失血患者，經常導致炎癥相關的晚期并發癥，由于急性創傷破壞皮膚的保護屏障并抑制免疫系統，使得患者易受細菌感染。一旦細菌在傷口定植，可在受損組織內快速增殖，經常導致彌散性感染，由于感染進行性加重，可以導致菌血癥和膿毒血癥、嚴重膿毒血癥及膿毒性休克等臨床癥狀，引發全身炎癥、患者發熱或體溫過低、白細胞增多或白細胞減少、心動過速、呼吸急促或分鐘通氣量超常，具有高病死率[6-8]。嚴重膿毒血癥和膿毒性休克的患者，常常經歷“血液學衰竭”：血細胞系和復雜的凝血和(或)抗血栓形成蛋白異常，出現貧血、血小板減少、白細胞減少、彌散性血管內凝血和凝血因子的功能缺陷[9-10]。在膿毒血癥患者中，血管內血容量不足是典型且嚴重的癥狀，需要快速、準確及大劑量輸注液體進行復蘇。膿毒血癥及膿毒性休克患者循環治療的主要措施是采用液體及血管加壓藥物來復蘇，用于保持最佳的器官灌注狀態。此外，血管加壓素是治療嚴重膿毒血癥和膿毒血癥休克的二線藥物，對于盡管有足夠的液體復蘇仍然低血壓或進展為心源性肺水腫的患者有效。在應急及特殊環境下，由于儲存及運輸條件的限制，儲存RBCs的輸注就不可避免。

儲存RBCs輸注存在增加感染性疾病并發癥的風險，這主要與懸浮RBCs在儲存過程中引發的RBCs特性的改變有關[11-14]。RBCs儲存期間會發生顯著的形態、結構、生物化學和代謝變化，伴隨著潛在的有害生物活性產物的釋放，這些變化被稱為“儲存損傷”[5]。在儲存期間，RBCs的形態由于氧化損傷、生化變化和微泡化而逐漸出現RBCs形態的改變。在小鼠、犬及人類中的研究結果顯示，輸注儲存損傷的RBCs被單核吞噬細胞迅速從循環中清除，同時血紅蛋白迅速分解代謝，相關的鐵以一定的速度返回到血漿，超過轉鐵蛋白(生理鐵轉運蛋白)攝取的速率，從而產生循環的非轉鐵蛋白結合鐵，促進了細菌的生長[4]。

因此，為解決儲存RBCs輸注誘導創傷后炎癥及增強感染這一臨床問題，必須選取合適的動物模型及可靠的監測技術對動物的細菌感染情況進行監測。如今，生物發光成像正在成為一種對活體動物治療效果進行量化的有效技術，其優點是[15-16]：所需動物數量少；可在同一動物中監測疾病的過程；跟蹤識別病原體傳播途徑。

生物發光細菌僅由活細菌產生，在不添加底物或滅活細菌的情況下檢測生物發光信號，使得其成為用于實時監測細菌和高通量生物技術的理想報告物。本研究探討儲存RBCs輸注對細菌感染小鼠的作用，在小鼠靜脈內同時輸注新鮮或儲存RBCs及銅綠假單胞菌，發現儲存RBCs輸注促進了銅綠假單胞菌在感染小鼠體內的增殖，降低了小鼠的存活率。