AU5800型全自動生化儀對脂蛋白相關磷脂酶A2活性的檢測性能研究*

吳美玲 劉 斌 高 華 張炳昌 欒 芳*

脂蛋白相關磷脂酶A2(1ipoprotein-associated phospholipase A2，Lp-PLA2)是磷脂酶超家族中的亞型之一，又稱為血小板活化因子乙酰水解酶，由血管內膜中的巨噬細胞、T細胞和肥大細胞合成和分泌，血小板活化因子可促進其分泌。Lp-PLA2與脂蛋白顆粒結合的形式存在，與低密度脂蛋白結合的約占80%，其余與高密度脂蛋白和極低密度脂蛋白相結合；Lp-PLA2可水解氧化低密度脂蛋白中的氧化磷脂，生成溶血卵磷脂和氧化游離脂肪酸脂類等促炎物質[1-3]。在動脈粥樣硬化患者中，Lp-PLA2水平與低密度脂蛋白膽固醇(low density 1ipoprotein cholesterol，LDL-C)亞組分水平[4-5]呈正相關，是血管特異性的炎癥及與斑塊穩定性密切相關的新炎癥標志物，是冠心病和腦卒中及其他動脈粥樣硬化相關疾病的臨床預測指標[6-10]。

目前，Lp-PLA2檢測多采用酶聯免疫或化學發光的方法檢測其質量，對Lp-PLA2活性檢測的報道少見。AU5800型全自動生化分析儀檢測Lp-PLA2活性的優勢是可以與其他血脂指標同時檢測，方便臨床解讀化驗結果。為此，本研究對AU5800型全自動生化儀檢測Lp-PLA2活性的正確度、精密度、線性范圍、可報告范圍、參考區間和靈敏度進行分析評價。

1 資料與方法

1.1 標本來源

選取2017年7月在健康體檢中心體檢的20名健康體檢者，其中男性9名，女性11名；年齡18歲～59歲，平均年齡(33.55±12.10)歲；排除高血壓、高血脂、糖尿病、甲狀腺功能異常等疾病。清晨無劇烈運動，空腹采集靜脈血標本3 ml，離心后取血清于2 h內在AU5800型全自動生化儀上檢測。

1.2 儀器與試劑

BECKMAN AU5800型全自動生化儀(美國貝克曼庫爾特公司)，Lp-PLA2活性試劑盒(批號Z170501)及配套校準品(重慶中元生物技術有限公司 批號Z170501)，原裝質控品(低值批號170501、高值批號170502)，速率法檢測。

1.3 檢測方法

1.3.1 正確度驗證

依據國家衛生行業標準“臨床檢驗定量測定項目精密度與正確度性能驗證”(WS/T492-2016)文件[11]要求，檢測Lp-PLA2活性試劑盒配套校準品(校準品可溯源至DRE-XA15590400ME)15次，計算15次連續測定結果的均值。測定值與理論值相比較，與說明書參考值相對偏差≤10%作對照。

1.3.2 精密度驗證

(1)批內精密度。依據國家衛生行業標準(WS/T420-2013)和臨床實驗室標準化協會(clinical and laboratory standards institute，CLSI)EP5-A2文件[12-13]“定量測量方法的精密度性能評價”要求，取Lp-PLA2活性試劑盒配套低值質控品和高值質控品各1份，連續檢測20次，計算均數±標準差(M±SD)及變異系數(coefficient of variation，CV)。

(2)批間精密度。依據國家衛生行業標準(WS/T420-2013)和CLSI EP5-A2文件[12-13]要求，取Lp-PLA2活性試劑盒配套低值質控品和高值質控品各1份，連續檢測20 d，計算M±SD及CV。

實驗室自定義總允許誤差(total error allowance，TEa)為20%，批內精密度目標按1/4TEa計算即批內CV≤5%為符合要求，批間精密度目標按1/3 TEa即批間CV≤6.6%為符合要求。

1.3.3 線性范圍驗證

依據國家衛生行業標準(WS/T420-2013)和CLSIEP6-A文件[12-14]要求，選取接近線性范圍上限的高濃度血清標本(H)、低濃度血清標本(L)各一份，按高低比例H、6∶2、4∶4、3∶5及L混勻，測定每份標本分析物濃度3次取平均值作為實測值，以實測值為Y、理論值為X擬合一次線性回歸方程，評估Lp-PLA2在10.0～1500.00 IU/L范圍內的檢測是否呈線性。結果判斷：曲線回歸系數r2≥0.990。

1.3.4 可報告范圍驗證

選取濃度在接近線性范圍上限的高濃度血清標本，按照1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64以及1∶128的比例稀釋，每個濃度檢測3次，統計均值與理論值比較，以80%≤R≤120%定位可接受范圍。

1.3.5 參考區間驗證

依據國家衛生行業標準(WS/T402-2012)，從醫院健康體檢中心收集健康人血液標本20份，與說明書提供的參考范圍0～659 IU/L進行驗證，R≥90%符合要求。

1.3.6 靈敏度分析

Lp-PLA2連續測試6個樣本，查看各測吸光度變化量⊿A，通過⊿A=A2-A1，計算樣本濃度為檢測范圍內時，分析靈敏度的變化。⊿A≥0.02 mA/min·L/IU，符合要求。

1.4 統計學方法

采用Graphpad Prism 5軟件對數據進行統計學分析和作圖。均數采用±s表示，理論值和實測值的線性關系分析通過擬合一次線性回歸方程。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 正確度

可溯源至DRE-XA15590400ME的校準品連續測定15次，計算均值為530.4 mg/l，理論值為515.0 mg/l，偏差2.99%，符合要求，見表1。

表1 AU5800型全自動生化儀測定Lp-PLA2活性的準確度

2.2 精密度

2.2.1 批內精密度

試劑盒配套低值質控品和高值質控品分別連續檢測20次，變異系數CV分別為1.39%和2.67%，均＜5%，符合要求，見表2-1、表2-2。

2.2.2 批間精密度

每日測試試劑盒配套低值質控品和高值質控品，連續檢測15 d，變異系數CV分別為3.47%和3.00%，均＜6.6%，均符合要求，見表3。

2.3 線性范圍

以Lp-PLA2活性理論值(不同稀釋度)為X軸，實測均值為Y軸，得出回歸方程為Y=0.9961X+7.213(r2=0.9997)，顯示線性良好，線性范圍在9.63～1580.87 IU/L內，大于試劑盒說明書規定的10～1500 IU/L，且符合要求，其線性檢測情況如圖1所示、見表4。

2.4 可報告范圍

通過驗證，標本按照不同比例稀釋后，最大稀釋64倍在80%≤R≤120%可接受范圍之內，可報告范圍為9.63～101175.68 IU/L，見表5。

2.5 參考區間

隨機抽取20名健康者的血清進行Lp-PLA2活性測定，驗證廠家提供范圍0～659 IU/L，90%在范圍內為合格。實際側得范圍397.0～711.1 IU/L，95%在廠商給定參考范圍之內，符合要求，見表6。

表2-1 AU5800型全自動生化儀測定Lp-PLA2活性的批內精密度(1～12次)

表2-2 AU5800型全自動生化儀測定Lp-PLA2活性的批內精密度(13～20次)

表3 AU5800型全自動生化儀測定Lp-PLA2活性的批間精密度

表4 AU5800型全自動生化儀測定Lp-PLA2活性的線性范圍驗證(IU/L)

表5 AU5800型全自動生化儀測定Lp-PLA2活性的可報告范圍驗證(IU/L)

表7 AU5800型全自動生化儀測定Lp-PLA2活性的分析靈敏度驗證

圖1 AU5800型全自動生化儀測定Lp-PLA2活性范圍驗證的線性圖

2.6 分析靈敏度

連續測試6個標本進行Lp-PLA2活性測定，實際檢測濃度在檢測范圍內時，試劑吸光度平均變化⊿A=0.0869≥0.02，符合中元生物試劑說明書要求，見表7。

3 討論

Lp-PLA2是心血管疾病中一種新的炎癥標記物，在動脈粥樣硬化的發病、進展和斑塊破裂中起關鍵作用，是近幾年來心血管領域研究的重點和熱點。相對于C反應蛋白、白介素等傳統的炎癥指標，Lp-PLA2在心血管疾病的診治中具有特異性高的優勢。本研究實驗室在AU5800型全自動生化儀引入Lp-PLA2活性檢測，與低密度脂蛋白膽固醇、同型半胱氨酸以及小而密低密度脂蛋白膽固醇等血脂指標組合，方便臨床對心血管疾病風險的評估。

表6 AU5800型全自動生化儀測定Lp-PLA2活性的參考區間驗證

本研究依據國家衛生行業標準(WS/T 420-2013、WS/T 492-2016、WS/T 402-2012)以及CLSI EP5和EP6文件的要求，評估了AU5800型全自動生化儀檢測Lp-PLA2活性的性能。結果顯示，AU5800型全自動生化儀檢測Lp-PLA2活性的正確度較高，偏差為2.99%；批內不精密度和批間不精密度均在實驗室設置的精密度目標之內；檢測線性范圍為9.63～1580.87 IU/L，可報告范圍為9.63～101175.68 IU/L，滿足臨床檢測需要；正常人群參考區間驗證和靈敏度驗證均符合要求。

2018年4月，美國《臨床化學》雜志報道，傳統免疫法檢測Lp-PLA2質量時，由于受Lp-PLA2與脂蛋白結合存在形式干擾，導致檢測結果偏低，使得Lp-PLA2質量和活性檢測結果不一致；串聯質譜法(LC-MS/MS)檢測Lp-PLA2質量時，可以把Lp-PLA2與脂蛋白完全解離，Lp-PLA2質量和活性檢測結果一致[15]。但是，串聯質譜法檢測Lp-PLA2標本前處理復雜、成本高，因此AU5800型全自動生化儀檢測Lp-PLA2活性更能滿足于臨床需求，LC-MS/MS檢測的Lp-PLA2活性與AU5800型全自動生化儀檢測的Lp-PLA2活性結果是否一致，尚需進一步研究。

AU5800型全自動生化儀測定Lp-PLA2活性，具有快速簡便、準確度高、重復性好等優點，適合臨床大批量標本的檢測，適用于心內科、神經內科等科室對心腦血管疾病風險評估。