天然產物提取及其抗氧化測定設計實驗

楊玉琴 皇甫鑫強 李俊莉

一、天然產物提取及其抗氧化測定設計實驗的意義

資源、環境與持續發展戰略問題已成為人類社會所面臨的全球性熱點問題，要求人們必須高效精細地利用有用資源，其中，生物資源更由于其獨特性及重要的社會經濟價值，其應用開發廣布社會各個領域。我國有著獨特和豐富的天然植物資源，因而對其有效成分的分離和研究十分重要。植物在我國的應用已達幾千年之久，甚至形成了獨特的中藥文化，并且總結出了中藥獨特的用藥方法，其有效性經過了大量的臨床驗證，其科學性毋庸置疑。天然產物種類繁多，廣泛存在于自然界中且天然產物中化學物質的研究和深加工利用具有重要的社會經濟價值。

另一方面，由于環境的污染、添加劑濫用以及社會壓力增加等因素，人體內的自由基數量激增，抗氧化系統的平衡遭到了破壞，過量的活躍自由基對人體細胞進行攻擊，細胞會受到損傷甚至死亡，研究表明很多重大疾病和衰老都與過量自由基的產生有關聯。然而使用合成抗氧化劑對人體健康有潛在危害，如二丁基羥基茴香醚（BHA）在動物實驗中是致癌的，因此在植物中尋找安全的天然抗氧化物質及其應用的研究工作引起了人們的重視。植物中提取的抗氧化活性成分主要有多糖類化合物、黃酮類化合物、多酚類化合物、生物堿、皂苷類、維生素等。研究天然植物抗氧化活性成分的提取及檢測方法，對新型抗氧劑的開發及抗氧劑抗氧機理的研究具有重要的意義。

二、抗氧化測定原理

1.DPPH自由基清除法

DPPH法于1958年被提出，廣泛用于定量測定生物試樣和食品的抗氧化能力。DPPH自由基存在不成對電子，其無水乙醇溶液呈紫色，在517 nm處有最大吸收。DPPH比色法主要利用自由基清除劑提供一個電子與DPPH自由基的故對電子配對，使自身紫色變為黃色，在517 nm波長處的吸光度變小，其變化程度與自由基清除程度呈線性關系，即清除自由基能力越強，吸光度越小。

2.HO·自由基清除法

利用芬頓反應，讓二價鐵離子（Fe2+）和過氧化氫之間的鏈反應生成羥基自由基（HO·），羥基自由基具有極強的得電子能力，可氧化水楊酸產生在510nm處有吸收的有色物質。有自由基清除劑存在時將消耗羥基自由基，通過測定水楊酸被羥自由基氧化所得到的產物，可以確定HO·自由基的清除率。

3.超氧陰離子清除

超氧陰離子自由基作為生物體代謝過程中產生的一種自由基，與機體衰老和各種疾病有很密切的關系，因此測定超氧陰離子自由基清除能力有很重要的意義，可采用鄰苯三酚自氧化法測定待測液清除超氧陰離子的能力。在弱堿性條件下，鄰苯三酚能發生自氧化反應，生成超氧陰離子和有色中間產物，該中間產物在320nm處有一特征吸收峰。當加入超氧陰離子清除劑時，它能迅速與超氧陰離子反應，從而阻止中間產物的積累，使溶液在320nm處光吸收減弱。故可以通過測定吸光度值來評價清除劑對超氧陰離子的清除作用。

4.總還原能力測定

還原能力測定的原理是：

K3[Fe（CN）6]+樣品→K4[Fe（CN）6]+樣品氧化物

K4[Fe（CN）6]+Fe3+→Fe4[Fe（CN）6]3

在波長700nm處測定吸光度A，A值越大，表示樣品的還原能力越強。

三、實驗方案

確定本次實驗設計的目的：了解天然產物分離、提純的基本方法;了解天然產物有效成分的基本應用;了解并掌握天然產物提取的基本操作;了解天然產物成分用于抗氧化測定的基本方法;加深對實驗技能的掌握及提高查閱文獻資料的能力。

實驗室提供的具體條件：常規玻璃儀器、超聲儀、天平、水浴鍋、紫外分光光度計、及氧化測定的常規試劑及其他可能使用到試劑（提前檢查設計方案以確定儀器及試劑情況）。

實驗流程：給定實驗名稱（說明實驗背景和要求，明確實驗要求）→確定提取物→收集原料并進行預處理→查閱資料確定提取目標產物根據產物特點確定該抗氧化活性成分的提取方法→初步完成實驗設計方案，連同預處理的原料交由指導教師檢查通過→進行實驗→分析→總結。

四、實驗評分與效果

以往實驗往往根據實驗過程中的操作及其實驗數據結果給出得分，在我們的評價體系中，傳統評價只占實驗評分中的一部分。由于實驗時間安排在大三下學期，在實驗中本就有意引導學生將在前面學習的無機、有機、分析等分類學習實驗課程中的的基本知識和基本技能加以綜合運用融會貫通，達到在高層次上對知識的整體把握和靈活應用，所以實驗評分系統中的總結與分析占據主導。更重要的是，通過獨立設計完成實驗，加強了學生運用所學知識分析和解決實際問題，有利于培養學生進行科學研究的能力和態度，為后續的畢業論文工作打下堅實的基礎，故需要學生在總結與分析給出實驗存在的問題，尤其是對該實驗的后續開展做出分析給出可以繼續進行實驗的方案，依據學生提供出的可行性變量因素進行評分，這也使得有的課題延伸成為了學生的畢業論文。完成設計實驗后再寫畢業論文，可以提高學生在畢業論文工作中的創新能力和綜合水平，提高了畢業論文的質量。

近年來，普通高等學校要有一定數量的綜合性、設計性實驗是教育部《普通高等學校本科教學工作評估方案》提出的要求，綜合設計實驗以研究性和設計實驗為主，可分為綜合實驗和設計實驗。設計實驗根據課程要求給出命題，讓學生從查閱資、設計和實施實驗方案、分析及表征實驗結果來培養學生正確設計實驗，獨立思考和獨立開展化學實驗的能力，以提高學生的思維能力、解決問題的能力和創新意識。為此，我們從2014年針對大三學生開設化學綜合設計實驗課程，并依托大學生創新創業平臺改進實驗教學內容及方案，實驗中涉及的知識面廣 ，融合了無機合成、有機合成及其分析化學中的定性定量分析、光譜分析、化學分析及樣品處理等多方面的知識，有效地提高了學生綜合素質和創新能力。