珍珠舌草膠囊揮發油對胃癌細胞增殖與凋亡的影響及機制研究

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(1.山西省中醫院，山西 太原 030001；2.山西醫科大學第二醫院，山西 太原 030013)

胃癌是消化系統最常見的惡性腫瘤，全球每年新確診病例約93.4萬人，位居所有惡性腫瘤的第二位[1]。慢性萎縮性胃炎(Chronic atrophic gastritis，CAG)伴癌前病變則大大增加胃癌的發病率，因此延緩和阻止甚至逆轉癌前病變的病理性進程能夠有效預防胃癌的發生。

目前西醫缺乏治療慢性萎縮性胃炎伴癌前病變(腸化生和異型增生)的有效方法，治療多以緩解癥狀為主，還沒有行之有效的阻斷和逆轉該病的西藥。中醫藥治療胃癌前病變具有一定的優勢[2]。本課題組2007～2012年先后兩次運用珍珠舌草膠囊對CAG伴癌前病變進行臨床研究[3,4]，經臨床反復驗證，發現其在改善慢性萎縮性胃炎臨床癥狀，降低胃黏膜慢性炎癥、Hp感染等方面作用顯著。甚至還可以逆轉腸化生和異型增生。

珍珠舌草膠囊全方中枳實、莪術和蒲公英等富含揮發油[5-7]。研究證實，多種揮發油具有抗腫瘤作用[6,7]，本研究旨在觀察珍珠舌草膠囊全方揮發油對AGS細胞增殖和凋亡的作用并對其機制進行研究。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑與儀器

AGS細胞株購于中國科學院細胞庫；Ham’s/F-12 培養液購于北京鼎國昌盛生物技術有限公司；胎牛血清(FBS)購于杭州四季青生物工程有限公司；DMSO(二甲基亞楓)和RNase A(核糖核酸酶A)購于金科宏達生物公司；MTT購于上海日初生物科技有限公司；PI(Propidium iodide,碘化丙啶)購于美國Sigma公司；胰酶購于美國Invitrogen公司；33342/PI 試劑盒購于中國Beyotime公司；Annexin V購于美國BioVision公司；各種規格培養板購于北京鼎國昌盛生物技術有限公司；SpectraMAX 190 微孔讀板機購于美國分子儀器公司(MD，USA)；FACScan 流式細胞儀購于美國BD公司(Becton Dickinson，USA)；ModFitLT V3.0軟件和熒光顯微鏡購于日本Olympus公司。

1.2 原藥材

珍珠舌草膠囊中黃芪、枳實、白術、木香、砂仁、丹參、莪術、珍珠層粉、蒲公英、白花蛇舌草等藥材購于山西國新晉藥集團有限公司。

1.3 珍珠舌草膠囊全方揮發油的提取

依據2010版中國藥典附錄VD揮發油測定法甲法提取，首先將珍珠舌草膠囊方一帖粉碎成粗粉轉移至1 000 mL原底燒瓶，加入8倍量水浸泡 5 h左右，加入沸石，連接揮發油提取器，檢查氣密性后武火煮沸，改成文火保持微沸約8h至不再有揮發油提出后，停止加熱，放置片刻，開啟測定器下端活塞，將水緩緩放出，至油層上端達到刻度0線上面5 mm處為止，放置1 h以上，再開啟活塞使油層下降至其上端恰與刻度0線平齊，讀取揮發油量，存放于密閉棕色玻璃瓶中待用。

1.4 細胞培養

AGS細胞培養于含10%FBS的Ham’s/F 12 培養液，置于37°C、5 % CO2的細胞培養箱中培養。

1.5 細胞活力的檢測

細胞存活率檢測 AGS細胞接種于96孔板內，接種密度為1.0×104個細胞/mL，每孔接種200 μL，使其貼壁過夜。采用信封法分組，給予不同濃度(0、40、80、160μg/mL)的珍珠舌草膠囊揮發油干預AGS細胞的生長(n≥6)，孵育12 h和24 h后，加入20 μL的MTT，接著孵育4 h，棄培養基和MTT，加入150 μL的DMSO(二甲基亞砜，dimethy sufoxide)，振蕩混勻15 min，570 nm處OD值用SpectraMAX 190微孔讀板機檢測，生長抑制率按[1-(用藥組OD值 /未用藥組OD值) ]× 100 %計算。

1.6 細胞周期的檢測

AGS細胞以2×104個/mL濃度接種在6孔培養板中，過夜待細胞貼壁后，將培養液換成不含血清的培養基，饑餓以同步，繼續培養24 h后，換上含有藥物和不含藥物的新鮮培養基，含藥物濃度為40、80、160μg/mL,細胞孵育12、24 h，按細胞周期檢測步驟進行實驗。作用時間到達后用0.25%的胰酶消化細胞，用冷PBS終止消化，吹打細胞，移入離心管中。棄上清，冷PBS洗兩次。離心去PBS，加入1mL PBS重懸細胞，吹入冰預冷的無水乙醇固定，4℃，6h以上。1 000 rpm離心5 min棄去固定液，2 mL冷PBS洗兩次，離心后棄上清。4℃用PI染液染色，避光孵育30min。流式細胞儀檢測。

1.7 細胞凋亡檢測

AGS細胞以2.5×104個/mL密度接種在6孔培養板中，每孔3 mL，貼壁24 h后，將培養液換成不含血清的培養基，饑餓以同步，繼續培養24 h后，換上含有藥物和不含藥物的新鮮培養基，珍珠舌草膠囊揮發油濃度為40、80、160μg/mL，允許細胞生長12、24 h，作用時間到達后從培養箱中取出細胞，收集細胞上清，加0.125%胰酶消化細胞，37 ℃約1 min，加含血清的細胞培養液終止胰酶的作用，輕柔吹打細胞，并收集細胞與上清一起，切忌損傷細胞。冰冷PBS(4 mL)中離心(300 g，5 min)，棄上清，旋渦振蕩器點動分散細胞后，加入4 mL Annexin V結合緩沖液再次洗滌細胞一次后完全棄上清。將細胞分散后加入500 μL Annexin V結合緩沖液重懸細胞，隨后加入FITC標記的Annexin V 1μL(終濃度1μg/mL)，再次點動混勻，隨后冰浴30 min，中間取出再混勻1次。30 min后，加入4 mL Annexin V結合緩沖液洗滌細胞，棄上清后，點動分散細胞，加入500 μL Annexin V結合緩沖液重懸細胞，置于冰浴中保存。上機前加入PI(終濃度5μg/mL)，并立即上機檢測。

1.8 Caspase 3活性檢測

AGS細胞以2.5×104個/mL密度接種在6孔培養板中，貼壁過夜，換上含有藥物和不含藥物的新鮮培養基，含有藥物培養液濃度40、80μg /mL，允許細胞生長12、24 h，0.25%胰酶消化，細胞數需達到(1～5)×106個，離心1 500 rpm 5 min，懸浮細胞于50μL冰冷細胞裂解液10 min，10 000 g離心1 min，收集上清，冰上放置，然后進行蛋白濃度測定，將50～200μg蛋白用細胞裂解液補充至50 μL，加入50μL的2×反應緩沖液(含10 mM DTT)，加入5 μL的4 mM的DEVD-pNA(200μM終濃度)，37 °C孵育1～2 h，在酶標儀405 nm處測定吸光值(OD)。

1.9 統計學方法

2 結果

2.1 珍珠舌草膠囊全方揮發油對胃癌細胞活力的影響

40～160μg /mL的全方揮發油干預細胞12 h，可使AGS細胞活力從92.40%下降到19.60%；干預細胞24 h，可使AGS細胞活力從72.60%下降到6.10%，呈良好的濃度和時間依賴性。見表1(12 h組間比較，F=2 549.15；24 h組間比較，F=8 189.36，P<0.05)。

表1 珍珠舌草膠囊全方揮發油對AGS細胞活力的影響 %

注：1)與同組比較，P<0.05

2.2 珍珠舌草膠囊全方揮發油對細胞周期的影響

珍珠舌草膠囊全方揮發油干預胃癌細胞12 h能阻滯細胞于G2/M期，提示其能抑制胃癌細胞的分裂，從而阻止胃癌細胞的增殖，12 h從17.47%上升至32.53%，表明珍珠舌草膠囊全方揮發油干預胃癌細胞AGS細胞能阻滯胃癌細胞周期于G2/M期。見圖1(組間比較，F=182.57，P<0.05)。

圖1 珍珠舌草膠囊全方揮發油對胃癌細胞周期的影響(12 h)Figure1 Effects of ZZSCB Volatile Oil on the Cell Cycle ofGastric Cancer(12 h)

圖1A Control組細胞周期圖示
圖1B 珍珠舌草膠囊全方揮發油40μg /mL組細胞周期圖示
圖1C 珍珠舌草膠囊全方揮發油80μg /mL組細胞周期圖示
圖1D 珍珠舌草膠囊全方揮發油160μg /mL組細胞周期圖示
圖1E 珍珠舌草膠囊全方揮發油對細胞周期的影響

珍珠舌草膠囊全方揮發油干預胃癌細胞24 h能阻滯細胞于G2/M期，從19.07%上升至38.79%，表明珍珠舌草膠囊全方揮發油干預胃癌AGS細胞能阻滯胃癌細胞周期于G2/M期。見圖2(組間比較，F=705.68，P<0.05)。

2.3 珍珠舌草膠囊全方揮發油對細胞凋亡的影響

流式細胞儀檢測結果表明，珍珠舌草膠囊全方揮發油0 μg/mL、40 μg/mL、80μg/mL、160μg/mL干預胃癌細胞12 h后，早期凋亡率分別為5.30%、10.50%、13.60%、17.60%，見圖3(組間比較，F=242.8，*P<0.05, **P<0.01)。干預24 h后，早期凋亡率分別為7.60%、11.30%、18.20%、25.00%，見圖4(組間比較，F=3 050.53，*P<0.05, **P<0.01)，具有時間和濃度的依賴性。

2.4 珍珠舌草膠囊全方揮發油對Caspase 3活性檢測的影響

珍珠舌草膠囊全方揮發油干預AGS細胞12 h，40μg /mL組和80μg /mL組Caspase 3的活性分別是對照組的1.90倍和4.31倍，見表2(組間比較，F=282 807.00，P<0.05)。干預24 h后，則是對照組的3.19倍和8.74倍，見表2(組間比較，F=15 081 762.2，P<0.05)。提示全方揮發油能呈時間和濃度依賴性地增加Caspase 3的活性，與對照組比較差異具有統計學意義(P<0.05)。

圖2 珍珠舌草膠囊全方揮發油對胃癌細胞周期的影響(24 h)Figure2 Effects of ZZSCB Volatile Oil on the Cell Cycle ofGastric Cancer(24 h)

圖2A Control組細胞周期圖示
圖2B 珍珠舌草膠囊全方揮發油40μg /mL組細胞周期圖示
圖2C 珍珠舌草膠囊全方揮發油80μg /mL組細胞周期圖示
圖2D 珍珠舌草膠囊全方揮發油160μg /mL組細胞周期圖示
圖2E 珍珠舌草膠囊全方揮發油對細胞周期的影響

圖3 珍珠舌草膠囊全方揮發油對胃癌細胞凋亡的影響(12 h)Figure3 Effects of ZZSCB Volatile Oil on the Apoptosis ofGastric Cancer Cells(12 h)

圖3A Control組細胞凋亡圖示
圖3B 珍珠舌草膠囊全方揮發油40μg /mL組細胞凋亡圖示
圖3C 珍珠舌草膠囊全方揮發油80μg /mL組細胞凋亡圖示
圖3D 珍珠舌草膠囊全方揮發油160μg /mL組細胞凋亡圖示
圖3E 珍珠舌草膠囊全方揮發油對細胞凋亡的影響

圖4 珍珠舌草膠囊全方揮發油對胃癌細胞凋亡的影響(24 h)Figure4 Effects of ZZSCB Volatile Oil on the Apoptosis ofGastric Cancer Cells(24 h)

表2 珍珠舌草膠囊揮發油對Caspase3活性的影響 %

3 討論

珍珠舌草膠囊由黃芪、枳實、白術、木香、砂仁、丹參、莪術、珍珠層粉、蒲公英、白花蛇舌草等組成。本研究通過體外實驗結果顯示珍珠舌草膠囊全方揮發油能很好地抑制胃癌AGS細胞生長，阻滯細胞于G2/M期，誘導細胞凋亡。細胞增殖與凋亡的平衡對于保持胃腸黏膜的完整性具有重要意義[8，9]。一旦這種平衡被破壞，就會誘發慢性萎縮性胃炎或胃癌前病變甚至是腫瘤的發生[9，10]。腸化生和異型增生打破了正常胃黏膜細胞增殖與凋亡的平衡，增加了胃癌發生的機率，周期阻滯和誘導凋亡是抑制細胞生長的兩個重要的因素。本研究證實珍珠舌草膠囊全方揮發油能顯著抑制AGS細胞的生長，可能與其阻滯細胞于G2/M期并促進AGS凋亡有關。Caspase 3是這兩條途徑的一個主要環節，珍珠舌草膠囊全方揮發油能顯著增強Caspase 3的活性，其干預AGS細胞12 h，40 μg /mL組和80 μg /mL組Caspase 3的活性分別是對照組的1.90倍和4.31倍，干預18 h后，則是對照組的3.19倍和8.74倍。提示全方揮發油能呈時間和濃度依賴性地增加Caspase 3的活性。珍珠舌草膠囊全方揮發油能顯著促進AGS細胞凋亡，可能與其增強Caspase 3的活性有關。

研究表明，白術中含有蒼術醇、蒼術酮、萜烯類化合物具有抑菌、抗腫瘤的作用[6]，枳實中檸檬烯具有抗炎作用[5]，莪術中的莪術油也具有抗腫瘤的作用[6]，蒲公英和白花蛇舌草都含有亞麻酸，具有抗炎[7]、抗腫瘤[11]的作用，黃芪中黃酮類具有顯著的增強機體免疫力的作用[12]，木香中萜類具有抗炎、抗腫瘤和抗潰瘍的作用[13]。砂仁中揮發油具有抗炎、鎮痛和止瀉的功效[14]，丹參中桃拓酚具有很強的抑菌以及抗氧化作用[15]。珍珠舌草膠囊全方揮發油中許多有效成分具有抗炎、抗潰瘍、抑菌、調節胃腸道微循環、抗腫瘤和增強機體免疫力的作用。這可能是珍珠舌草膠囊治療CAG伴癌前病變甚至是消化系統腫瘤的有效成分。

綜上所述，珍珠舌草膠囊全方揮發油具有較好的抑制細胞生長的作用，此作用可能與其阻滯細胞周期、促進細胞凋亡有關，促凋亡作用可能通過Caspase 3的活性增強實現，該結果為珍珠舌草膠囊抗腫瘤研究提供了實驗依據。