變換波長HPLC法同時測定藥食同源降脂片中橙黃決明素、蘆丁和槲皮素含量

陳靜 丁潔 沙芮 李瑞賓 牛犇

摘要：采用Gemini C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流速為1 mL/min，柱溫40 ℃，波長切換（0～20 min，在370 nm波長下檢測蘆丁，20～30 min，在280 nm波長下檢測槲皮素和橙黃決明素），進樣量20 μL，流動相為甲醇（A）-水（B）。結果表明，橙黃決明素在1.977 2～98.860 0 μg/mL（R2=0.999 7）線性關系良好，平均回收率為98.81%，RSD為2.0 %;蘆丁在1.958 0～97.900 0 μg/mL（R2=0.999 6）線性關系良好，平均回收率為98.16%，RSD為2.2%;槲皮素在2.283 6～114.18 μg/mL（R2=0.999 6）線性關系良好，平均回收率為100.44%，RSD為3.0%。藥食同源降脂片中橙黃決明素平均含量0.053 2 mg/g，RSD為1.36%;蘆丁平均含量0.847 0 mg/g，RSD為0.65%;槲皮素平均含量0.040 9 mg/g，RSD為0.80%。該方法操作簡便、準確、穩定、重復性好，可用于藥食同源降脂片的質量控制。

關鍵詞：高效液相色譜法（HPLC）;橙黃決明素;蘆丁;槲皮素;藥食同源降脂片

中圖分類號：S132? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）02-0111-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.02.025? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

據2017年中國新近公布的流行病學資料顯示，全國血脂異常的患病率為18.6%，現有患者1.6億人，研究開發新型純天然中藥降脂類藥物及保健品十分重要。目前臨床上廣泛應用他汀類藥物來治療高血脂癥并預防心腦血管病癥意外發生，療效較顯著。但長期或大劑量使用他汀類藥物可能會導致心臟橫肌紋溶解、肝臟組織細胞生物化學變化等嚴重不良反應[1，2]。

本研究所用的藥食同源降脂片是由山楂（去核）、決明子、洋蔥、黃瓜和枸杞等純天然物質經過粉碎、提取、濃縮、干燥、打粉、壓片而制得，具有降血脂、活血通經、益精血等作用。其中，決明子中的橙黃決明素[3，4]、山楂中的三萜酸和黃酮[5-8]、枸杞中的多糖和木耳多糖、洋蔥中的蒜氨酸酶[9]等均對降低血脂有顯著功效。且有研究表明，決明子和山楂配合在一起有較好的降血脂作用[10]。

決明子為臨床常用中藥，是國家衛生部公布的既是食品又是藥品的中藥材，臨床應用表明其降脂作用明確[11]，療效可靠、副作用少，但與其他傳統中藥一樣，存在著成分復雜、機理不十分清楚等缺點。據近年來的研究報道，決明子中的專屬成分橙黃決明素能顯著增強LDLR基因轉錄水平，為決明子中有效降脂成分，已有基于GC-MS的代謝組學研究了橙黃決明素治療高血脂癥大鼠血漿中代謝物的變化，多元統計分析證實了橙黃決明素可以較好地調節高血脂癥大鼠血脂水平。橙黃決明素作用于氨基酸及脂肪酸的代謝通路，能夠達到較好的調脂作用。

山楂是一種常用中藥，味酸、甘，性微溫，歸脾、胃、肝經，具有消食健胃、行氣散疲功能，用于肉食積滯，胃脘脹滿，瀉痢腹痛，疲血經閉，產后疲阻，心腹刺痛，病氣疼痛、高脂血癥等。近年來，更廣泛用于治療心血管疾病和抗菌消炎，引起國內外學者的注意和重視。山楂降壓、增加冠脈血流量、降低血脂、耐缺氧、強心、抗心率不齊的有效成分為黃酮類化合物，其主要成分為蘆丁、金絲桃普、槲皮素等，而黃酮類化合物的藥理研究也顯示降血脂作用[12]。故本研究選擇橙黃決明素、蘆丁和槲皮素作為藥食同源降脂片的質量評價指標，建立了HPLC法同時測定藥食同源降脂片中的橙黃決明素、蘆丁和槲皮素含量，為該制劑的質量控制提供依據。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料

橙黃決明素對照品（52850010）、蘆丁對照品（E2260050）、槲皮素對照品（E3680050）購于上海安譜實驗科技股份有限公司（純度均>98%）;藥食同源降脂片（甘肅省商業科技研究所，批號2017010606）;甲醇為色譜純（Amethyst Chemicals，LCB0M02），水為去離子水，其他試劑均為色譜純。

1.2? 試驗儀器

UPT-I-20L型落地式純水機（四川優普超純科技）;XS225A型電子分析天平（普利塞斯，瑞士）;LC-20A型高效液相色譜儀（島津）。

1.3? 方法

1.3.1? 工藝流程? 原料→分揀→粉碎→提取→過濾→濃縮→噴霧干燥→干粉→輔料配比→混合→濕法制粒→干燥→整粒→總混→壓片→包裝→成品。

1.3.2? 溶液配制

1）對照品溶液。分別精密稱取橙黃決明素、蘆丁和槲皮素對照品0.004 95、0.004 93和0.005 82 g，分別置于10 mL容量瓶中，加入甲醇定容成含橙黃決明素0.494 3 mg/mL，蘆丁0.489 5 mg/mL，槲皮素0.570 9 mg/mL的標準儲備液溶液。

2）供試品溶液。取藥食同源降脂片20片，研細，精密稱取細粉1 g，置10 mL量瓶中，加入淀粉酶溶液1 mL，調節pH在4～5。將樣品溶液在室溫下放置7～8 h，使藥片中淀粉水解，加入純甲醇溶液加熱回流4 h，冷卻后揮干溶劑，用甲醇定容至10 mL，經0.22 μm濾膜過濾，取濾液為供試品溶液。

1.3.3? 色譜條件及系統適應性試驗? 色譜條件：Gemini C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流速1.0 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量20 μL。檢測波長為0～20 min，370 nm;20～30 min，280 nm。流動相為水（A）∶甲醇（B）=70∶30。橙黃決明素、蘆丁、槲皮素色譜峰分離良好。

2? 結果與分析

2.1? 線性試驗

分別精密吸取橙黃決明素、蘆丁、槲皮素混合對照品溶液，稀釋至濃度為2、10、50、80、100 μg/mL。以進樣量（μg）對峰面積（A）進行線性回歸，得橙黃決明素、蘆丁、槲皮素回歸方程見表1，表明橙黃決明素在1.977 2～98.860 0 μg/mL線性關系良好，蘆丁在1.958 0～97.900 0 μg/mL線性關系良好，槲皮素在2.283 6～114.180 0 μg/mL線性關系良好。

2.2? 精密度試驗

分別吸取橙黃決明素、蘆丁、槲皮素儲備液各10 μL，用甲醇定容至1 mL，連續進樣6次，計算橙黃決明素、蘆丁和槲皮素峰面積的RSD分別為0.53%、0.64%和0.52%，表明精密度良好。

2.3? 重復性試驗

取同一批藥食同源降脂片，按“1.3.2”方法制備6份供試品溶液，在上述色譜條件下進樣測定，結果顯示橙黃決明素、蘆丁、槲皮素平均含量為0.053 2、0.847 0和0.040 9 mg/g，RSD分別為1.36%、0.65%和0.80%。

2.4? 穩定性試驗

精密稱取樣品細粉1 g，按“1.3.2”方法制供試品溶液，分別于配制后0、2、8、16和24 h各進樣20 μL，得橙黃決明素、蘆丁和槲皮素色譜峰峰面積的RSD分別為1.24%、0.79%和1.46%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.5? 加樣回收試驗

取己知各成分含量的藥食同源降脂片20片（橙黃決明素含量0.053 2 mg/mL，蘆丁含量0.847 0 mg/mL，槲皮素含量0.040 9 mg/mL），研細后精密稱取細粉0.5 g，共6份（相當于含橙黃決明素0.026 6 mg、蘆丁0.423 5 mg、槲皮素0.020 4 mg），至10 mL容量瓶中，加入橙黃決明素對照品溶液54 μL（質量濃度0.494 3 mg/mL）、蘆丁對照品溶液865 μL（質量濃度0.489 5 mg/mL）、槲皮素對照品溶液36 μL（質量濃度0.570 9 mg/mL），按“1.3.2”條件配制，進樣測定，結果見表2。

2.6? 樣品含量測定

取3瓶樣品，每瓶藥品隨機取3組藥片，按“1.3.2”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，結果見表3。藥片中橙黃決明素平均含量0.053 2 mg/g，RSD為1.36%;蘆丁平均含量0.847 0 mg/g，RSD為0.65%;槲皮素平均含量0.040 9 mg/g，RSD為0.80%。

3? 討論

關于高效液相色譜法同時測定蘆丁和槲皮素含量的文獻[13-15]較多，測定決明子中橙黃決明素含量的文獻[16-18]也不少，但同時測定橙黃決明素、蘆丁和槲皮素的方法尚未見報道，本研究通過多次嘗試，根據3種物質的最大吸收波長，最終確定了通過變換波長法同時測定以上3種物質的高效液相色譜條件。關于流動相的選擇問題，其他報道中測定以上3種成分的流動相多為甲醇、磷酸水及乙腈，本研究嘗試采用甲醇和水作為流動相，仍然可取得較好的分離效果，達到了更加安全環保的成效，并可減少化學溶劑的使用。

4? 結論

本試驗建立了高效液相色譜法同時測定藥食同源降脂片中橙黃決明素、蘆丁和槲皮素含量的方法。結果表明，流動相為水（A）∶甲醇（B）=70∶30的條件下，橙黃決明素、蘆丁和槲皮素可以較好得分離。該方法簡便、快速、準確、可靠、重復性強，經測定藥食同源降脂片中橙黃決明素平均含量0.053 2 mg/g，RSD為1.36%;蘆丁平均含量0.847 0 mg/g，RSD為0.65%;槲皮素平均含量0.040 9 mg/g，RSD為0.80%，為藥食同源降脂片的質控提供了依據。

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