不同產地廣藿香的SCoT分子鑒定

席秀利 胡珊 鄔龍怡 孟鶴

摘要：通過提取廣藿香[Pogostemon cablin （Blanco）Benth.]DNA，正交設計PCR反應體系，篩選獲得廣藿香PCR擴增的SCoT引物，應用NTsys 2.10e軟件并采用UPGMA法進行聚類分析，對分布于廣州、陽江、肇慶、湛江和海南等共16個居群的廣藿香樣品進行分子鑒定。結果表明，SCoT引物堿基序列共擴增出167條條帶，其中多態(tài)性條帶有108條，多態(tài)百分率占64.7%，各品種間的相似系數(shù)分布在0.69～0.91，不同產地廣藿香分別聚為一類。表明不同產地廣藿香有豐富的遺傳多態(tài)性，且SCoT分子標記可以作為不同產地廣藿香的鑒定依據(jù)。

關鍵詞：廣藿香[Pogostemon cablin （Blanco）Benth.];SCoT;分子鑒定;正交

中圖分類號：R282? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）02-0084-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.02.019? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

廣藿香為唇形科植物廣藿香[Pogostemon cablin （Blanco）Benth.]干燥地上部分，為“十大廣藥”之一。其味辛，性微溫，歸脾、胃、肺經，具有芳香化濁，開胃止嘔，發(fā)表解暑的功效[1]。藥材市場傳統(tǒng)上將廣蕾香分為牌香（廣州產）、肇香（肇慶產）、湛香（湛江產）和南香（海南產）[2]。廣藿香不同產地的分化類型，是適應特定環(huán)境的結果，本質上由遺傳變異所決定[3]。目前，真正意義上的道地藥材石牌藿香已經不復存在，經驗認為肇慶地區(qū)的廣藿香的品質與石牌藿香相近，亦供藥用，而海南藿香和湛江藿香不供藥用，主要用于提取揮發(fā)油[4]。為了進一步利用廣藿香藥材資源，充分發(fā)揮廣藿香這一著名南藥的價值，有必要將不同品種廣藿香進行區(qū)分。

SCoT（目標起始密碼子多態(tài)性分子標記，Start

codon targeted polymorphism）是Collard和Mackill開發(fā)的基于SPAR（單引物擴增反應）的新的目的基因分子標記方法[5]。SCoT標記結合了ISSR標記和RAPD標記的優(yōu)點，操作簡單，成本低，引物通用，多態(tài)性豐富，可用于分子輔助育種[6]。分子鑒別成為一大趨勢，目前廣藿香品種鑒定的分子生物研究有RAPD[7]、MSAP[8]、SRAP[9]、ITS[10]、psbA-trnH[11]，然而鮮見有關SCoT標記在廣藿香親緣關系鑒定中應用的研究報道。因此，本研究將來自不同產地包括廣州市、湛江市、陽江市、肇慶市、海南省等地的廣藿香樣品進行SCoT分子標記鑒定，以期為廣藿香育種及其藥材質量鑒定提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

采集16個不同產地廣藿香樣品（表1），經廣州中醫(yī)藥大學黃海波副教授鑒定為廣藿香，憑證標本保存于香雪制藥有限公司研發(fā)中心。詳細記錄樣品信息及編號，用75%乙醇清潔葉表面后保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2? 儀器和試劑

分析天平，離心機，核酸蛋白測定儀（Implen Nanophotometer），PCR儀（BIO-RAD），凝膠成像儀（BIO-RAD），超低溫冰箱（Thermo 902-ULTS），電泳儀、電泳槽（BIO-RAD），制冰機，水浴鍋。

dNTPs、Ex Taq DNA聚合酶、Mg2+、10×Ex Taq Buffer、Loing Buffer（Takala），Maker 3（廣州東盛生物科技有限公司），瓊脂糖（Biowest），Golden View核酸染料（北京博凌科為生物科技有限公司），TAE（50×）[生工生物工程（上海）股份有限公司]，植物基因組提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]，參考Collard等[5]提供的36條SCoT引物序列。

1.3? 方法

1.3.1? 基因組DNA提取與檢測? 采用天根植物基因組試劑盒提取基因組DNA。用微量紫外核酸儀檢測DNA濃度和純度。將合格樣品DNA濃度稀釋至20 ng/μL后置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2? SCoT-PCR 反應體系正交優(yōu)化? 選用L16（54）正交試驗設計（表2），對Mg2+、dNTPs濃度、Ex Taq DNA聚合酶、引物和DNA用量進行5因素4水平的正交試驗。以廣藿香GZ的DNA為模板，隨機挑選S12號引物作為擴增引物，反應總體積20 μL，含有10×PCR Buffer 2 μL，每處理重復2次。

1.3.3? SCoT-PCR引物篩選? 根據(jù)正交試驗結果選擇最佳反應體系對36條引物進行篩選，設平行組。接著對篩選后的引物進行溫度篩選，在PCR儀上設定50～60 ℃溫度區(qū)間，即50.0、50.9、52.3、54.0、56.3、58.1、59.3、60.0 ℃ 8個溫度梯度進行退火溫度篩選。然后選擇湛江市、陽江市、肇慶市高要區(qū)3個不同產地的廣藿香DNA為模板，按照上述優(yōu)化的SCoT-PCR體系進行SCoT分子標記，篩選出多態(tài)性好、條帶清晰的引物。

1.3.4? SCoT-PCR 擴增與檢測? PCR擴增反應在PCR儀上進行，擴增程序為94 ℃預變性5 min;94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán);72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。擴增反應結束后，取10 μL擴增產物加入2 μL 6×loading buffer，采用2.0%瓊脂糖凝膠，在1×TAE電極緩沖液中，120 V，電泳30 min檢測條帶，凝膠成像儀下拍照。

1.4? 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)PCR擴增產物的電泳結果，對清晰且易于辨認的條帶采用“0/1”系統(tǒng)記錄其位置，建立SCoT標記的0/1矩陣。用NTsys 2.10 e軟件計算樣品間的相似系數(shù)，并用不加權成對算術平均法（UPGMA）進行聚類分析。

2? 結果與分析

2.1? DNA提取結果

將提取的所有廣藿香樣品在超微量紫外分光光度計下測量其濃度和純度，得到其A260 nm/A280 nm均在1.8～1.9，說明其DNA純度高，符合PCR的技術要求。

2.2? SCoT-PCR反應體系正交優(yōu)化結果

使用引物S12對反應體系優(yōu)化的電泳結果，參考桂騰琴等[12]直觀評價法依次對結果多態(tài)性進行評分，條帶數(shù)量豐富、清晰的計16分，涂布或無條帶的計1分，反應1～16組體系的平均整數(shù)計分依次為8、9、15、16、8、9、11、12、10、10、7、9、13、12、14、11分。依照計分原則，計算同一水平下各個因素的平均值Kn（表3）。根據(jù)各因素水平下的得分數(shù)據(jù)平均值Kn（K值得分最高）可以確定各個因素的最適濃度。由表3中的K值可以初步確定5個因素的最適用量分別為1×PCR buffer，3.0 mmol/L Mg2+，0.30 mol/L dNTPs，0.6 μmol/L Primer，1.25 U ExTaq酶，40 ng模板DNA。但鑒于1.00 U Ex Taq酶與1.25 U Ex Taq酶組評分不相上下，從經濟角度考慮體系最終確定為1×PCR buffer，3.0 mmol/L Mg2+，0.3 mol/L dNTPs，0.6 μmol/L Primer，1.00 U Ex Taq酶。

2.3? 引物篩選及退火溫度優(yōu)化

以最佳反應體系對36條SCoT通用引物進行篩選，重復2次初篩選出20條引物，進行8個退火溫度梯度篩選，根據(jù)信號強度判斷條帶，采用區(qū)間溫度對篩選的引物進行匹配最終獲得在52、56、59 ℃ 3個溫度擴增下的18條引物。其中，S33和S34號引物的退火溫度梯度電泳結果。

2.4? SCoT擴增的多態(tài)性分析

以湛江市、陽江市、高要區(qū)3個地域差異大的樣品對退火優(yōu)化后的18條引物進行多態(tài)性篩選，最終獲得16條擴增帶型完整、清晰、多態(tài)性豐畗的引物（表4）。利用這16條引物對16份材料進行SCoT擴增，共獲得總條帶167條，其中多態(tài)性條帶共108條，多態(tài)百分率占64.7%，多態(tài)性比率較高，在分子水平上證實了廣藿香具有豐富的種內遺傳多樣性。S25、S29號引物對16份材料SCoT-PCR擴增電泳結果。

2.5? SCoT標記的遺傳相似性及聚類分析

利用NTsys 2.10e軟件構建全部材料基于SCoT數(shù)據(jù)的UPGMA樹狀圖。16份材料兩兩之間的相似系數(shù)在0.69～0.91，其中湛江市的Z2與Z3樣品以及肇慶市的Q1與Q2，同廣州市龍洞的P2與N1相似度最高達0.897。而海南省隆江鎮(zhèn)的樣品N2與其他樣品親緣關系較遠，相似度僅有0.69。以相似系數(shù)0.80為閾值可將16份材料劃分為4組，其中湛江市的3個樣品和陽江市的3個樣品聚為一支;肇慶市高要區(qū)的3個樣品與2個牌香樣品、南香N1、廣藿香GZ則聚為一支;廣藿香GY和南香N2分別單獨成為一支。由此可見，地域靠的越近的廣藿香樣品相似度較高，且親緣關系更近，不同產地廣藿香大致聚為一類。說明SCoT分子標記可以作為不同產地廣藿香的鑒定依據(jù)。

3? 小結與討論

SCoT標記作為一種新型的目的基因分子標記，在試驗過程中發(fā)現(xiàn)該方法不僅具有操作簡單，而且重復性好，同時引物通用性強。本試驗從最初的36條SCoT通用引物中最終篩選出16條清晰、條帶豐富的引物作為不同產地廣藿香SCoT分子標記的引物，驗證了其穩(wěn)定性及可靠性。篩選的16條SCoT引物擴增多態(tài)百分率占64.7%，在分子水平上證實了不同產地廣藿香樣品具有豐富的種內遺傳多樣性。

通過NTsys 2.10e軟件進行相似系數(shù)和UPGMA聚類分析發(fā)現(xiàn)，16份樣品廣藿香的相似度分布在0.69～0.91，而以相似度0.80為界限，所有樣品聚為4支。從聚類分析中可以看到，不同產地廣藿香樣品相似度較高，基本聚為一類。然而同一個地方培育的不同品種受地理位置影響，親緣關系更近，相似度高，以同采于廣州市龍洞的牌香P2與南香N1樣品為例，兩者相似度達到0.897。而產于海南省隆江鎮(zhèn)的N2樣品卻與其他樣品相似度較低，親緣關系較遠，這說明了基因表型可能受到地理位置的影響發(fā)生變化，這與劉玉萍等[3]研究認為廣藿香不同產地的分化類型是適應特定環(huán)境的結果，本質上由遺傳變異所決定的結論一致。因此，從結果分析得知SCoT分子標記可以在分子層面上對不同產地廣藿香進行大致區(qū)分，可作為不同產地廣藿香的鑒定依據(jù)。

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