大規模平行測序在混合斑檢測分析中的應用前景

（四川大學華西基礎醫學與法醫學院法醫研究所，四川 成都 610041）

法庭科學中，混合斑是指兩名或兩名以上個體的體液、分泌液混合形成的生物斑痕，常出現于性犯罪案件、多人受傷的現場血跡、咬痕拭子及指甲垢等。由于受到混合成分的種類、個體數量以及各組分在混合斑中所占比例等因素的影響，混合斑的鑒定比單一個體來源斑痕的鑒定復雜得多[1]。目前，混合斑檢測分析主要依賴于毛細管電泳（capillary electrophoresis，CE）分離技術，但此技術分辨率有限，并不能完全發揮各遺傳標記的效能，拆分能力受限。同時，檢測得到的電泳圖譜的分型結果受多種因素的影響而使其結果解釋較為復雜[2-6]。近年來，大規模平行測序（massively parallel sequencing，MPS）技術發展逐漸成熟，與傳統的CE分離技術相比，MPS不僅能獲得遺傳標記的序列信息，而且具有同時檢測多種遺傳標記的能力[7-10]?；贛PS平臺衍生出的數據分析軟件大幅度提高了分析混合斑的可能性，為混合斑檢測分析帶來了新的契機。

1 CE分離技術

1.1 基于CE分離技術的遺傳標記分型

目前，CE分離技術是混合斑檢測分析的常規技術，常用的遺傳標記包括常染色體和Y染色體短串聯重復（short tendem repeat，STR）序列、單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）、線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）、插入缺失（insertion or deletion，InDel）多態性等。常染色體STR的優勢在于其多態性好、個體識別能力強，在混合斑分析中的作用明顯。Y-STR檢測無需兩步消化，可避免DNA的損失，通常每個男性個體僅有一個等位基因，因此可根據分型圖譜中Y-STR等位基因的數目推定混合斑的供者個數，對輪奸案的分析有重要意義。mtDNA在混合斑降解檢材鑒定中有重要作用，可用于混合斑來源個體數的推定[11]。二等位基因SNP和InDel用于混合斑分析時，相比常染色體STR更易獲得供者的遺傳圖譜，且無stutter峰干擾，但其識別效力有限[12]。基于此，CE分離技術鑒定混合斑中次要供者所占比例的檢測限在10%左右[4]。

1.2 統計分析方法解釋

目前，STR-CE分離技術分析混合斑的統計方法主要有包含概率（probability of inclusion，PI）法和似然率（likelihood ratio，LR）法。PI法又稱為隨機男子不能被排除率（random man not excluded，RMNE）法，是指隨機個體被錯誤地認定為存在于混合斑中的概率，對應于統計學中的“Ⅰ型錯誤”。若累積父權指數（combined probability of inclusion，CPI）小于 10-9，則幾乎可以完全確定嫌疑人存在于混合斑中[13-14]。該法不必對混合斑的供者個數進行假設，計算簡單且容易解釋。但其對結果的解釋有時不保守，未充分利用信息，不考慮等位基因丟失或其他隨機效應，若出現基因座丟失，解釋比較困難[13，15]。LR法是通過兩個對立假設來評估遺傳分析提供的證據強度的方法。原告假設（prosecutions hypothesis，Hp）指分型結果由一名嫌疑人和額外的未知無關個體構成，被告假設（defense hypothesis，Hd）指分型結果由一個或多個未知個體構成。將混合樣本DNA分型結果定義為E，則：

式中，Pr為Hp或Hd條件下獲得E的概率，E為檢材的DNA分型結果。該方法能最大程度利用信息，假設靈活，考慮了等位基因丟失、等位基因插入等PCR隨機效應的因素，只是計算較復雜，解釋較為困難[15]。國際法醫物證學會（International Society for Forensic Genetics，ISFG）推薦使用LR法進行混合斑分析[17]。

1.3 分析軟件

CE分離技術分析混合斑的常用軟件主要有LoComatioN軟件（英國Forensic Science Service公司）、GeneMapper?ID-X軟件（美國Thermo Fisher Scientific公司）、TrueAllele?DNA Interpretation軟件（美國CybergeneticsMenu公司）、Forensim軟件包（Hinda Haned開發）等。LoComatioN軟件是第一個用LR統計分析方法評估解釋混合斑的專門系統，考慮了等位基因丟失和等位基因插入的因素[18]。Gene-Mapper?ID-X軟件用于分析解釋兩人混合斑，可計算嫌疑人與受害人參考樣本的條件LR[19]。TrueAllele?DNA Interpretation軟件可同時有效解決多個案件信息，利用獲得的DNA分型數據與嫌疑人進行比較并計算證據統計量——LR，評價嫌疑人的相關性[20]。Forensim軟件包可模擬司法鑒定中常見的DNA分型數據，包含4種統計學方法，專用于解釋混合斑[21]。

1.4 CE分離技術的局限性

CE分離技術分析混合斑時存在一些局限性。例如，由于受到熒光染料數量的限制，目前最多能復合檢測30個左右的STR位點或50個左右的SNP位點，提供的信息量相對較少（只提供片段長度大小），達不到復雜混合斑分析的信息量要求[22]。大多數商品試劑盒包含的STR位點的PCR片段在80～500 bp，當檢測降解混合斑檢材時常常導致較長PCR片段的STR位點信號明顯下降甚至丟失，造成分型困難[3]。由于STR基因座中復合序列和（或）復雜序列的存在導致CE分離技術無法得到STR基因座的全序列信息而不能區分長度一致的序列等位基因，造成次要供者的等位基因常與stutter峰混淆或被主要供者的等位基因掩蓋[3，22-23]。同時其電泳分型圖譜中的加A不全、等位基因缺失、等位基因插入等均影響正確分型模式的推斷，給混合斑鑒定帶來了困難[6]。

2 MPS技術

MPS技術，又稱二代測序（second generation sequencing，SGS）技術或下一代測序（next generation sequencing，NGS）技術，其核心思想是邊合成邊測序，即通過捕捉新合成的末端標記來確定DNA序列。MPS技術可以同時在一個反應內完成數十萬到數百萬條DNA分子片段的序列測定。此技術近年來發展迅速，其在測序通量、測序讀長、測序成本等方面的突破，使法醫遺傳學進入了一個新的發展階段，且法醫遺傳學領域關于MPS技術的研究文獻呈爆發式增長，這些成果為解決法醫遺傳學難題（如混合斑）提供了新的可能性[24]。

2.1 MPS技術的優勢

MPS技術下不同基因座的識別基于引物序列，不受限于熒光染料數量，可同時對數百甚至數千個大小重疊的遺傳標記進行檢測；借助條形碼技術可同時對多個樣本進行檢測。由于無需熒光染料標記，基因座間檢測片段可相互重疊，可將目標片段設計在300bp以內，大大提高了降解檢材的分析能力。MPS技術產生的完整DNA序列將長度多態性轉化為序列多態性，增加了基因座的等位基因數量，從而提高了系統效能。同時，能對多種不同類型的遺傳標記進行聯合檢測，使一次反應產生更大的信息量，為分析混合DNA 提供了一個新的研究方向[5，9，25-30]。

2.2 MPS技術檢測混合斑常用遺傳標記

目前常用的遺傳標記均能應用MPS技術進行檢測，如STR、SNP、InDel、mtDNA、微單倍型等。

2.2.1 STR

STR識別能力較強，在混合斑中的作用明顯。目前，多家MPS公司推出了商品化的MPS-STR的檢測試劑盒，如PowerSeqTMSystem（美國Promega公司）、PowerSeqTMAuto System（美國Promega公司）、Ion TorrentTMHID STR 10-plex（美國Thermo Fisher Scientific公司）、Precision ID GlobalFilerTMNGS STR Panel（美國Thermo Fisher Scientific公司）。借助MPS技術能檢出大量序列等位基因，大大增加系統效能。van der GAAG等[3]應用PowerSeqTMSystem在MPS平臺上進行兩人混合斑分析，通過計算未與其他等位基因或stutter重疊的次要供者的等位基因覆蓋度所占比例來推斷混合比例，結果表明，隨著混合斑中次要供者比例減少，對次要供者的定量預測的準確性降低，但當次要供者所占比例為1%時仍可得到完整分型。

2.2.2 SNP

SNP通常為二等位基因遺傳標記，突變率極低（約1×10-9），無stutter峰產生。應用MPS技術，可大大提高SNP的檢測數量，增加系統效能。美國Thermo Fisher Scientific公司于2014年推出HID-Ion AmpliSeqTMIdentity Panel，應用MPS技術可同時檢測90個常染色體SNP和34個Y-SNP。有研究[31]表明，混合斑的純合子數量相對單一個體較少，混合比例在1∶49到49∶1之間時仍可得到次要供者的完整分型。此外，還有許多其他SNP試劑盒，如GeneRead DNASeq SNP panel PCR試劑盒（美國Qiagen公司）、HID-Ion AmpliSeqTMAncestry Panel（美國 Thermo Fisher Scientific公司）等。

2.2.3 InDel

InDel為二等位基因，可簡單分為短InDel和長InDel，突變率與SNP相近，兼具STR和SNP的某些特征。應用MPS技術可大大提高InDel的檢測數量，增加系統的個體識別能力。當進行混合斑分析時，比常染色體STR更容易獲得供者的遺傳圖譜，且無stutter峰干擾，不受混合斑供者性別的限制，混合斑的檢測限為 1∶1000[4，12，32-35]。WENDT 等[36]提出了一個包含68個InDel的體系，在MiSeq（美國Illumina公司）平臺上進行檢測并運用STRait Razor v2.5軟件分析數據，結果表明，InDel應用于混合斑分析有很大的潛力。

2.2.4 mtDNA

mtDNA是細胞核外DNA，具有高拷貝性、異質性，多用于分析無足夠核DNA的樣本（如毛干、陳舊骨骼）。應用MPS技術，當每個核苷酸位置的覆蓋度達成千上萬時，可檢測1%～2%的低水平變異，從而解析其異質性[37-38]。KIM等[39]應用Roche 454 GS Junior平臺（美國454 Life Sciences公司）對mtDNA的高變區（hypervariable region，HV）Ⅰ和HVⅡ進行檢測，分析兩人混合斑，結果表明，次要供者所占比例為2.5%及以上時，能得到完整分型，次要供者所占比例為1%時除HVⅡ的150位點外均能得到分型，因此其對兩人混合斑生物檢材的檢測靈敏度高（1.0%～2.5%），該平臺也能區分三個供者的不同序列。此外，HOLLAND等[40]的研究也表明，當覆蓋度在1000以上時，1%的次要供者能被成功檢出。

2.2.5 微單倍型

微單倍型是指在200 bp內包含兩個或兩個以上SNP，并有三個或三個以上等位基因的遺傳標記，其篩選應避免重組熱點。與SNP、InDel相比，其多態性有所增加；與STR相比，其突變率低，不會產生stutter峰且擴增片段短，適用于降解檢材[41-43]。運用MPS技術可同時檢測大量微單倍型，增加系統效能。KIDD等[41]篩選了31個高雜合性的微單倍型，應用MPS技術平臺進行研究，結果表明，微單倍型具有定性分析混合斑及定量分析混合斑中各組分的潛力（若在一個位點上有足夠覆蓋度的三個或三個以上不同序列，則證明為混合斑，且其相應的覆蓋度可確定混合斑各組分比例），因此可成為混合斑分析有力的檢測遺傳標記。

2.2.6 組合遺傳標記

將各種不同類型的遺傳標記組合在一個試劑盒中同時進行檢測，可結合各種遺傳標記的特點，提高運作效率，使一次實驗產生的信息量最大化。目前，已經研發出的組合遺傳標記試劑盒有MiSeq FGxTMForensic Genomics System（美國Illumina公司）和ForenSeqTMDNA Signature Prep試劑盒（美國Illumina公司）等。其中MiSeq FGxTMForensic Genomics System由58個STR、94個個體識別SNP、22個表型信息SNP和56個祖先信息SNP組成，應用MiSeq FGxTM平臺（美國Illumina公司）對兩人混合斑進行檢測，研究結果表明，當次要供者所占比例低于5%時仍能被檢出[22]。

2.3 MPS技術常用數據分析軟件

隨著MPS技術的發展，相關數據分析軟件應運而生。對于MiSeq平臺，My-Forensic-Loci-queries（MyFLq）[44]可用于對原始MPS數據進行STR和SNP的分析，MiSeq Reporter（美國Illumina公司）軟件分析后的數據可以再運用NextGENe?軟件（美國SoftGenetics公司）進行二級分析，ForenSeqTMUniversal Analysis軟件可同時管理實驗設置并進行數據分析[29]。針對Ion PGM平臺，STRait Razor軟件[45]可依靠智能的并行處理減少分析時間，Torrent Suite Server（美國Thermo Fisher Scientific公司）可根據不同實驗選擇不同的插件進行分析[10，31]，即將推出的Converge軟件（美國Thermo Fisher Scientific公司）可對數據進行三級處理。

2.4 MPS技術在混合斑分析中的應用展望

綜上所述，MPS技術檢測混合斑中次要供者的檢測限約為1%，相比STR-CE分離技術更為靈敏。微單倍型有望成為混合斑檢測的有力工具，為混合斑分析提供了新的研究方向。但是，MPS測序平臺及相關試劑的成本、相關技術產品的推出及驗證、分析軟件的成熟化、與現有數據庫接軌等都是決定該技術能否替代PCR-CE分離技術普遍應用于混合斑檢測的關鍵。期望后續能研發出更加完善的應用MPS技術的檢測系統，并將MPS技術的成本降低到一個可以接受的水平，同時開發出成熟、便捷、準確的MPS數據分析軟件，從而使MPS技術在混合斑分析中發揮更大的潛能。