OCT對冠狀動脈粥樣硬化及心肌梗死的法醫病理學輔助診斷

李洋，張寧，王成銘，何光龍

（1.公安部物證鑒定中心 法醫病理損傷技術處，北京 100038；2.公安部物證鑒定中心 視頻偵查技術處，北京 100038；3.清華大學物理系，北京 100084）

在法醫影像學領域，目前的研究主要基于CT進行人體三維重建開展死后虛擬解剖。虛擬解剖能夠在短時間內對尸體進行全身檢查，作出影像學診斷，在分析顱腦損傷、高墜及其他常規解剖難以發現機體損傷的案件中發揮著重要作用[1]。但是，基于CT技術的虛擬解剖，其限制在于平臺要求高，重建時間長，對操作者有一定放射傷害，分辨率較光學顯微鏡低，無法發現微米級的病變結構和組織，因此對于組織器官顯微結構的影像觀察仍然依賴傳統法醫病理學技術[2]。傳統法醫病理學技術主要對尸體、離體器官組織進行系統解剖，從而解釋死亡原因、死亡時間、損傷時間、致傷物推斷等問題。通常情況下，法醫病理學家需要通過對不同器官進行組織病理學檢驗，才能對死亡原因等問題做出正確的鑒定。經典的組織病理學檢查是利用蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色方法，在顯微鏡下觀察細胞水平上的變化，從而提高法醫病理學家對疾病或者損傷的診斷準確性。但是，病理切片制作過程復雜，對操作水平要求較高，人為假象、死后腐敗等因素也會干擾法醫病理學取材，對病理切片的結果產生負面影響。

光學相干斷層成像（optical coherence tomography，OCT）是近年出現的一種新型光學影像技術，其成像特點是對機體無損傷，無需接觸即可獲得具有極高空間分辨率的二維圖片，并能進一步形成三維斷層體成像，目前，OCT已開始應用于臨床醫學，并取得良好效果，如檢查眼球結構、冠狀動脈管腔等[3-4]。而在法庭科學領域，ZHANG等[5]指出OCT對不同品牌汽車油漆有較好的辨識度，有望成為交通事故現場快速檢驗的技術手段。目前，已有法醫學者開始研究OCT在法醫病理學中的應用價值。NAPOLI等[6]指出，在動物實驗中可利用OCT檢測眼角膜的厚度進而推斷死亡時間。BROWN等[7]通過觀察OCT圖像中蠅類蟲蛹發育程度而推斷死亡時間。

因此，本實驗擬觀察OCT橫切面圖像與傳統HE染色組織病理學切片的異同，以明確OCT在人體組織的成像特點，初步探索該技術在法醫病理學中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器與材料

OCT系統（自主搭建[5]），ShandonTMExcelsiorTMES組織脫水機、HistoStarTM組織包埋機、ShandonTMFinesseTME+石蠟切片機、VaristainTMGemini ES自動玻片染色機（美國Thermo Fisher Scientific公司），光學顯微鏡（日本奧林巴斯公司），Infinity2-3（美國Lumenera公司），Image-Pro Plus?6.0.0.260軟件（美國Media Cybernetic公司），多聚甲醛（國藥集團化學試劑有限公司），蘇木素（美國Thermo Fisher Scientific公司）和伊紅（北京九州柏林生物科技有限公司）。

1.2 實驗樣本

本次實驗樣本來源于公安部物證鑒定中心及北京市公安局法醫中心5名男性，死亡原因鑒定意見均為冠心病急性發作猝死，大體器官及組織病理學檢驗均可見左、右冠狀動脈粥樣硬化病理學改變。本研究分別采集每具尸體的心臟左右冠狀動脈粥樣硬化病變橫斷面、左心室前壁陳舊性心肌梗死橫斷面和正常心肌組織各1份，實驗樣本取材約為1.5 cm×1.5 cm×2.0mm。

1.3 OCT操作流程及相關參數

本研究中OCT系統深度分辨率約6 μm，橫向分辨率約7 μm，線掃描速率為70 kHz。系統使用寬帶超輻射發光二極管（superluminescent light-emitting diode，SLD）近紅外光源，中心波長為832 nm，譜帶半高全寬60.4 nm，輸出功率13 mW。曝光時間設置為15μs，系統信噪比約96dB。樣品的橫向掃描由樣品臂的一組掃描振鏡實現。振鏡與圖形采集保持同步。圖像采集、處理和顯示均由基于C++自主開發的軟件進行。三維圖像渲染由Visage ImagingTMAmira?5.3.3軟件（澳大利亞Visage Imaging公司）實現。

OCT操作過程：使用脫脂紗布將實驗樣本表面水分擦干，用解剖刀修平表面，將樣本放在OCT系統掃描平臺上，打開光源和振鏡，開啟數據采集軟件，設置電荷耦合器件（charge coupled device，CCD）積分時間為15 μm，掃描范圍6 mm×6 mm。定位掃面區域后，開啟采集按鈕對樣本表面進行掃描，即得到OCT圖像，采集時間0.5～1min。

1.4 組織病理學檢驗

實驗樣本浸沒于4%多聚甲醛-PBS液室溫固定24h后，進入標準脫水、浸蠟、包埋組織切片過程。以5 μm厚度連續切片，然后進行標準HE染色，中性樹脂封片后置于光學顯微鏡下觀察，利用Infinity2-3截取視野圖像。

1.5 測量指標

利用Adobe Photoshop CS6（美國Adobe公司）隨機測量10張OCT圖像、利用Infinity2-3測量10張組織病理切片中的動脈粥樣硬化灶纖維帽、中膜厚度及脂質池數量。

使用Image-Pro Plus?6.0.0.260軟件對正常心肌與陳舊性心肌梗死區各5張OCT圖像分別進行不同區域相同面積的累積光密度值（integrated optical density，IOD）測定。

1.6 統計學方法

通過形態學方法比較不同程度冠狀動脈粥樣硬化（Ⅰ級和Ⅳ級）[8]，心肌梗死病灶各結構在OCT圖像和光學顯微鏡上的異同。實驗數據采用±s表示，使用SPSS 22.0軟件對纖維帽、中膜厚度、脂質池數量進行配對樣本t檢驗，對正常心肌與陳舊性心肌梗死病灶的IOD值進行獨立樣本t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 Ⅰ級冠狀動脈粥樣硬化

光學顯微鏡（圖1A～B）能較好地區分管壁三層結構，其中內膜增厚，可見纖維增生及泡沫細胞等粥樣硬化早期病理學改變。

OCT圖像（圖1C～D）中，冠狀動脈中膜、外膜分層較清晰，并能清楚顯示內膜表面的纖維帽結構，此外內膜中可見光密度較低的增生纖維組織，內膜出現不連續性病理改變。

圖1 Ⅰ級冠狀動脈粥樣硬化

2.2 Ⅳ級冠狀動脈粥樣硬化

光學顯微鏡（圖2A～B）下，冠狀動脈內膜明顯增厚，粥樣斑塊形成并向管腔膨出。斑塊中可見灶性中性粒細胞浸潤，底部可見膽固醇結晶裂隙及無結構的粥樣物質。

OCT圖像（圖2C～D）可見，管腔狹窄嚴重，粥樣斑塊向管腔增生，斑塊中無定形物質的光密度呈不均勻結構。病變嚴重區域的中膜彈力纖維變薄。管腔中的血凝塊組織呈強光反射性。

圖2 Ⅳ級冠狀動脈粥樣硬化

2.3 心肌梗死灶

光學顯微鏡（圖3A）下可見陳舊梗死灶，表現為大量纖維瘢痕組織替代正常心肌，在纖維結締組織中血管明顯淤血（圖3B）。纖維組織與正常心肌組織界限較明顯，可見部分纖維組織插入周圍正常心肌中。

OCT圖像（圖3C）中正常心肌組織光信號較弱，呈高吸光性，而心肌梗死區纖維瘢痕組織內則顯示出較強光信號，呈低吸光性，正常心肌與陳舊心肌梗死區有較明顯的界限。此外，纖維組織中的血管呈高吸光性。淤血的血管與纖維結締組織有較好的辨識度（圖3D）。

2.4 其他組織

此外，我們通過對比心外膜OCT與HE圖像發現：OCT圖像中神經組織與血管中凝血塊均呈低吸光性，而脂肪細胞OCT圖像中能明顯區分細胞膜及內部脂滴（圖4）。

2.5 測量指標比較

分別測量OCT圖像和光學顯微鏡圖像上冠狀動脈粥樣硬化病灶處纖維帽和中膜的厚度，OCT圖像中冠狀動脈粥樣硬化灶纖維帽厚度平均為（55.24±25.08）μm，光學顯微鏡圖像上纖維帽厚度為（77.30±98.25）μm，兩者間差異無統計學意義（P=0.493）。OCT與HE圖像中的中膜厚度分別為（74.77±31.21）μm、（89.78±68.68）μm，兩者間差異無統計學意義（P=0.451）。OCT與HE圖像中的脂質池數量均為7個，差異無統計學意義（P＞0.05）。

正常心肌組織的IOD值（3 707.90±962.98）與陳舊性心肌梗死區的IOD值（1 226.24±622.66）之間差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖3 左心室前壁心肌梗死灶

圖4 心外膜下組織

3 討 論

在鑒定冠心病急性發作導致的猝死案件過程中，如果法醫病理學專家能借助輔助技術手段在尸體檢驗時快速、準確地取到病變組織并進行組織病理學檢驗，一方面能縮短法醫病理鑒定時間，另一方面也能為診斷提供輔助依據。

OCT作為一種新興影像學技術已被臨床學者用于指導冠心病早期預防、治療及預后過程。例如，KUME等[9]在臨床試驗中發現，OCT技術可以對活體冠狀動脈病變的程度進行有效評估，其圖像的分辨率優于目前臨床B超的結果。因為具有高分辨率、實時、穿透組織等特點，利用OCT可對組織進行簡便、快捷、直觀的光學影像觀察，這在法醫病理學快速篩查、初步診斷方面無疑是有一定應用價值的。ADLAM等[10]指出，OCT有希望成為一種對尸體損傷較小的診斷心臟性猝死的工具，遺憾的是ADLAM沒有討論OCT圖像與光學顯微鏡圖像之間的對應關系。而本研究結果顯示，OCT圖像與光學顯微鏡下HE圖像在動脈粥樣硬化病理特征，包括粥樣硬化斑塊、內膜纖維帽及內膜厚度變化等方面都有較好的相關性。

在法醫學實踐中，判斷血管內血栓成因對死后疾病診斷有重要價值。本課題組研究發現，在OCT圖像中，血管中的凝血塊呈現不同程度的光密度值。根據KUME等[11]的進一步研究，血栓成分不同可造成OCT圖像上血凝塊亮度上的不同。基于KUME等及本研究的結果，認為法醫病理學者可以利用OCT技術輔助區分血栓類型。

同時，本研究結果顯示，OCT圖像上正常心肌與陳舊性心肌梗死區之間存在明顯的界限，其原因可能為：相比正常心肌組織，纖維瘢痕較致密，對可見光、近紅外光具有較強的反射、散射能力。此外，正常心肌和陳舊性心肌病灶區的IOD值之間差異有統計學意義。這些結果都說明，OCT圖像能有效地辨識正常心肌組織和陳舊性心肌病灶。此外，在OCT影像中，除了冠狀動脈各層、心肌、纖維瘢痕等組織，神經、脂肪組織在OCT圖像與光學顯微鏡圖像中也有良好對應關系，這些表明，OCT能夠反映出HE染色結果。

本研究證明，OCT技術可在心臟大體檢驗時進行病理組織學的初篩，輔助法醫病理學專家對冠狀動脈粥樣硬化、心肌纖維化程度進行預判，有針對性地取材，以利于下一步工作。而對于其他重要器官，如腦、肺、腎等，OCT技術是否同樣能夠反映出組織病理改變仍需要進一步研究。