71個Y-SNP位點在西北漢族人群的多態性及法醫學應用價值

張立男 ，宋雨桐 ，姜磊 ，朱如心 ，李莉

（1.司法鑒定科學研究院 上海市法醫學重點實驗室 上海市司法鑒定專業技術服務平臺，上海 200063；2.華東政法大學，上海 200063）

單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）是指在基因組水平上由單個核苷酸變異引起的DNA序列多態性，是人類可遺傳變異中最常見的一種，占所有已知多態性的90%以上。SNP具有突變率低、可穩定遺傳、部分位點與個體外觀表現有關[1]、有利于降解檢材分析[2]、便于高通量自動化分型檢測等優點[3]。

Y染色體為男性特有的性染色體，除非發生突變，否則同一父系的男性后代均具有相同的單倍型，故可以用來揭示不同人群的起源、遷徙及親緣關系等。Y染色體上SNP位點（Y-SNP）分型檢測方法的建立，可以輔助現有的Y-STR檢測體系，協助進行疑難案件的鑒定。本研究采用多重PCR聯合基質輔助激光解吸/電離-飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）技術對西北漢族人群71個Y-SNP位點進行多態性調查，并結合前期研究所得，篩選同時適用于西北、華南和華東漢族群體的位點，旨在為法醫學應用提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 樣本

在知情同意原則下，收集西北新疆地區漢族男性無關個體血樣202份，每份樣本取200μL。

1.2 主要試劑和儀器

DNA抽提試劑盒QIAamp DNA Blood Mini試劑盒（德國Qiagen公司），基因分型系統Complete iPLEX?Gold Genotyping Reagent Sets（96 Format，美國 Agena公司），9700型PCR儀（美國AB公司），MassARRAY?飛行時間質譜儀、MassARRAY?納升點樣儀RS1000（美國Agena公司），MassARRAY Typer 4.0軟件（美國Agena公司）。

1.3 位點的選擇、優化及引物設計

通過Y染色體系統樹、Hapmap數據庫[4]、美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數據庫[5]進行檢索，結合《法醫SNP分型與應用規范》（SF/Z JD0105003—2015）的要求，從Y染色體上篩選出在東亞人群中具有多態性的71個SNP位點，用Agena Bioscience公司的在線工具[6]設計用于PCR擴增的引物和單堿基延伸反應的引物。

依據各個位點之間的距離并避免引物之間的相互干擾，將71個位點分成W1、W2、W3復合體系（表1）進行檢測，PCR擴增子的大小為80～120bp，單堿基延伸產物的相對分子質量為4429～8710。

表1 3個復合擴增體系所包含的Y-SNP位點

1.4 PCR擴增和產物純化

用QIAamp DNA Blood Mini試劑盒進行DNA抽提。擴增體系為5 μL，含10×PCR緩沖液0.5 μL、25 mmol/L MgCl20.4 μL、PCR 引物混合液 0.5 μL、25mmol/L dNTP混合液0.1μL、5U/μL PCR酶0.1μL、純水 1.4 μL、模板DNA 溶液 2 μL。PCR 循環參數：95℃ 2 min；95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 60 s，45個循環；72℃ 5 min。PCR擴增結束后，加入1.7 U/μL蝦堿性磷酸酶（shrimp alkaline phosphatase，SAP）0.30 μL、SAP 緩沖液0.17 μL 和超純水 1.53 μL，按下述條件進行酶切反應：37℃ 40min，85℃ 5min。

1.5 單堿基延伸反應

在純化后的產物中加入10×iPLEX?緩沖液0.20μL、單堿基延伸引物混合液0.94μL、10×iPLEX?終止 混合物 0.20 μL、iPLEX?酶 0.04 μL、超純水0.62μL，按下列條件進行單堿基延伸反應：94℃ 5s；52℃ 5s，80℃ 5s，5次小循環；40次大循環。

1.6 產物檢測

按參考文獻[7]中的方法對產物脫鹽后，使用Mass-ARRAY?納升點樣儀RS1000將反應產物點樣至芯片上（點樣量控制在8～12nL），將點樣完畢的芯片放入MassARRAY?飛行時間質譜儀進行質譜檢測，用Mass-ARRAY Typer 4.0軟件查看分型結果。

1.7 統計學分析

用直接計數法計算各Y-SNP位點在西北漢族無關男性人群中的等位基因頻率，基因多樣性（gene di-versity，GD）計算公式：

式中，n為樣本數，fi為第i個等位基因的分布頻率。單倍型多樣性（haplotype diversity，HD）[8]計算公式：

式中，n為單倍型數，Pi為第i個單倍型的頻率。用Arlequin v3.5軟件[9]計算單倍型頻率、Fst值和P值，并進行群體遺傳學比較。Fst是種群分化和遺傳距離的一種衡量方法，WRIGHT[10]建議：Fst為 0～0.05，群體間遺傳分化可以不考慮；Fst為0.05～0.15，群體間存在中等程度的遺傳分化；Fst為0.15～0.25，群體間遺傳分化較大；Fst＞0.25，則群體間有很大的遺傳分化。

2 結 果

2.1 西北漢族群體Y-SNP位點多態性分析

經過實驗和統計，得到西北地區漢族無關男性人群71個Y-SNP位點的等位基因頻率數據和GD值，有67個位點在西北漢族人群中呈多態性分布，詳見表2。

表2 西北漢族無關男性人群71個Y-SNP位點的等位基因頻率和GD值 （n=202）

表2顯示，在所選擇的位點中除M148、rs2032645、rs9306841、SRY8299外，其余67個位點都具有多態性，GD值在0.0100（rs11575897和rs9341278）～0.5022（rs17276358）。中度信息量（0.2≤GD＜0.3）的位點有22個（M117、M119、rs2032631、rs2032652、rs2032678、rs2075181、 rs35284970、 rs16980391、 rs16980396、rs3900、rs4589047、rs52812045、rs7067458、rs17174528、rs17250121、rs9306845、rs9306848、rs9785908、rs17276777、rs9786502、rs9786707、rs17842387），高度信息量（GD≥0.3）的位點有25個（M122、M134、rs2032674、rs11096432、rs2196155、rs13447361、rs2267801、rs16980363、rs3853054、rs16980426、rs16980601、rs16980610、rs16980641、rs16981290、rs917759、rs17269396、rs17269816、rs17269928、rs17286338、rs17276358、rs9786394、rs17316007、rs17316543、rs17316592、rs17323322）。

使用Arlequin v3.5統計軟件分析71個Y-SNP位點的單倍型發現，本群體共有170種單倍型，其中頻率最高的為0.034 8（7/202），頻率最低的只有0.005 0（1/202）。經計算，HD為0.9930。

2.2 華東、華南和西北漢族群體比較

結合前期的實驗結果[7，11]，用 Arlequin v3.5 軟件計算Fst值和P值，對華東、華南和西北漢族無關男性人群的等位基因分布進行比對分析（表3）。

表3 71個Y-SNP位點在華東、華南和西北漢族無關男性人群的等位基因分布差異

續表3

表3數據顯示：華東與西北漢族無關男性群體之間有7個位點存在中等程度以上的分化，華東與華南之間只有4個位點存在中等程度以上的分化，西北與華南之間有15個位點存在中等程度以上的分化。

71個位點中，分別有11個位點在華東與西北漢族群體的差異具有統計學意義（P＜0.05）、8個位點在華東與華南漢族群體的差異具有統計學意義（P＜0.05）、36個位點在華南與西北漢族群體的差異具有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 篩選在三個地域漢族群體均具有應用價值的位點

結合本實驗結果與前期研究取得的華南、華東漢族群體的遺傳學數據[7，11]，通過評價GD值，篩選出在西北、華南和華東群體具有較高信息量的Y-SNP位點。統計結果表明，在西北、華東和華南3個地域群體均具有應用價值的Y-SNP位點共有26個（表4）。

表4 在西北、華東和華南漢族群體中具有中、高度信息量的位點

續表4

3 討 論

3.1 多態性分析

觀察本實驗結果，分析檢測的71個Y-SNP位點在西北漢族無關男性人群的多態性及等位基因分布頻率，可知有67個Y-SNP在西北漢族男性人群中呈多態性分布，GD值在0.010 0～0.502 2，中度信息量（0.2≤GD＜0.3）的位點有22個，高度信息量（GD≥0.3）的位點有25個。本課題組前期研究結果[7，11]顯示，華南和華東漢族人群中分別有66、67個位點存在遺傳多樣性，中度信息量的分別有18、31個，高度信息量的分別有13、18個，整合本研究結果可知，同時適用于西北、華南和華東群體的中高度信息量的位點有26個。他們在親權鑒定和個體識別中具有一定的應用價值，可以作為STR、Y-STR檢測的補充。

3.2 群體分布差異分析

經比較分析P值，發現華南和西北漢族群體之間的差異最大，華東與西北漢族群體之間的差異次之，華東與華南漢族群體之間的差異最小。分析比較Fst值發現，西北與華南之間分化的程度最高，華東與西北漢族無關男性群體之間分化程度居中，華東與華南之間分化程度最低。由此可見，Y染色體上SNP標記的等位基因分布具有一定的地域差異，用于法醫學鑒定時，需要使用相應區域的群體遺傳學數據。

3.3 法醫學應用價值評估

目前，SNP在法醫學中的研究主要有兩個方面：（1）對SNP位點進行篩選，獲得不同人群的分布頻率，建立數據庫，用于個體識別和親權鑒定；（2）對SNP位點的功能進行分析，通過對現場遺留的生物檢材的部分位點進行分型，提供嫌疑人的一些特征，如毛發顏色、眼睛顏色等[12]。

本研究對西北漢族男性無關個體的71個Y-SNP位點進行分析，共檢測出170種單倍型，其中頻率最高的為0.034 8（7/202），頻率最低的只有0.005 0（1/202）。HD為0.993 0，得到了較大的群體遺傳信息，可應用于涉及男性的個體識別和親權鑒定的案例中。例如，在進行父系關系檢驗的時候，某些情況下僅僅憑借Y-STR分型的結果難以出具鑒定意見，不能因為幾個STR的分型結果不同而否定父系關系[13]，針對這種案例，對高信息量的Y-SNP位點進行分型檢測可以視為一種補充鑒定的手段。

同時，本實驗也比對了華南、華東地區漢族男性Y-SNP位點的分布特點，篩選出26個在西北、華南和華東漢族具有普適性的位點，這將有助于完善法醫DNA檢驗手段。