小鼠皮膚切創愈合過程中膜聯蛋白A1的表達

金馨 ，趙建新 ，姚藝 ，黃俊杰 ，范琰琰 ，喻林升

（1.溫州醫科大學法醫學系，浙江 溫州325035；2.溫州醫科大學司法鑒定中心，浙江 溫州325035；3.溫州醫科大學司法鑒定科學技術研究所，浙江 溫州325035）

膜聯蛋白是起源于鈣依賴性磷脂結合蛋白的超家族，其在結構上均具有由四個重復的60～70個氨基酸組成的保守中心結構域和承擔獨特功能的N端結構域[1]。膜聯蛋白 A1（annexin A1，ANXA1），又稱為依鈣蛋白、磷脂酶A2抑制蛋白，是該家族中第一個被發現的成員，在機體多數器官、組織中廣泛存在。有研究[2-4]表明，ANXA1存在于單核細胞、中性粒細胞等炎癥相關細胞中，在體內具有抗炎癥作用，參與炎癥過程的調控。ANXA1可以誘導抗炎因子產生，抑制磷脂酶A2活性，以及環氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）和一氧化氮合酶的形成，阻止花生四烯酸等炎癥介質的合成和釋放，抑制中性粒細胞的活性和游出等[5]。ANXA1也能促進凋亡細胞的清除，避免凋亡細胞轉化成壞死細胞引發炎癥反應[6]。此外，ANXA1也是血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）介導的內皮細胞遷移和血管生成的重要調節劑[7]。

皮膚創口愈合是一個復雜的過程，涉及炎癥反應、成纖維細胞增殖和組織重塑[8]，而愈合過程中相關生物學指標的改變可以為推斷損傷時間提供良好的參考依據。本研究檢測ANXA1在小鼠皮膚創口模型中的時序性表達和分布特征，旨在探討ANXA1在創口愈合中的作用及其在創口形成時間推斷中的參考價值。

1 材料與方法

1.1 樣本

清潔級健康雄性C57BL/KsJ小鼠45只，年齡8～10周，體質量30～35g，由南京生物醫藥研究院提供。

本實驗經溫州醫科大學倫理委員會審核通過，符合《實驗動物 福利倫理審查指南》[9]要求，盡量減少使用的動物數量和可能遇到的任何痛苦。

1.2 試劑

抗ANXA1抗體（ab137745，美國Abcam公司），兔二步法試劑盒（兔聚合物法檢測系統，PV-6001，北京中杉金橋生物技術有限公司），辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（H+L）（orb229657，英國Biorbyt公司），Immobilon-P卷膜（IPVH00010，德國Merk Millipore公司），RIPA裂解液（強）（P0013B）、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF） 100 mmol/L（ST506）、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠配置試劑盒（P0012A）及聚氰基丙烯酸正丁酯（butyleyanoacrylate，BCA）蛋白濃度測定試劑盒（P0010）均購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.3 損傷模型制作

40只小鼠（實驗組）背部剃毛，75%乙醇溶液消毒后，在乙醚麻醉下于背部中央做皮膚全層縱行切口，長度為1cm，不包扎及用藥。切創后分籠飼養，自由進食和飲水，光照12h/d，保證環境清潔，防止創口感染。分別于切創后6h、12h、1d、3d、5d、7d、10d、14d隨機選5只小鼠脫頸椎處死，以創口為中心，取創口及周邊處2.0cm×1.5cm大小的皮膚。5只小鼠（對照組）不做切創處理，脫頸椎處死后直接取相同部位同等大小皮膚。沿垂直創口方向將每組樣本平均分成三份，分別用于制作石蠟切片、蛋白質印跡分析、冰箱中備用（-80℃）[10]。

1.4 切片制備及染色觀察

將小鼠皮膚放入由磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）配制的4%多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）溶液中固定12 h后，經大量清水沖洗，乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制成5mm厚度連續切片，烘干后放于冰箱4℃保存。

1.4.1 常規蘇木素-伊紅染色

切片65℃烤片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，蘇木素染色5min，1%鹽酸-乙醇分化3s后自來水返藍30min，1%伊紅染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在光學顯微鏡下觀察創口的組織學形態。

1.4.2 免疫組織化學染色

切片常規脫蠟水化，3%H2O2孵育10min去除內源性過氧化物酶，微波熱修復法修復抗原，使用5%小牛血清在37℃烘箱內孵育30 min，抗ANXA1抗體（1∶1000）作為一抗4℃過夜，使用兔二步法試劑盒在37℃烘箱內孵育30min，二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木素染核。以PBS代替一抗作空白對照。在顯微鏡下觀察，ANXA1陽性染色顯示為棕黃色，每張切片在創口及其周邊區內隨機選擇10個視野，計算其中ANXA1陽性染色細胞數與募集細胞總數的比值。

1.5 蛋白質印跡分析

將各時間段的皮膚樣本分別剪碎，加VRIPA∶VPMSF=50∶1的混合液300 μL，組織勻漿，全程冰上操作。于冰上靜置20 min后，在4℃下以離心半徑10 cm，12000r/min，離心10min，吸取上清液，重復離心2次，用BCA法測量蛋白濃度后將樣品置于-80℃保存。于提取的蛋白樣本內加入5×蛋白上樣緩沖液，金屬浴100℃變性10 min，上樣總蛋白量為30 μg。用10%SDS-PAGE分離蛋白，再將蛋白轉印到Immobilon-P卷膜上，轉膜條件為250mA、50min。含有吐溫的Tris緩沖鹽溶液（Tris-buffered saline tween，TBST）洗滌3次，用5%脫脂牛奶封閉2 h，用抗ANXA1抗體（1∶5 000）孵育4℃過夜。TBST洗滌3次，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG使用TBST稀釋（VIgG∶VTBST=1∶5000）室溫孵育2h，TBST洗滌3次后，用電化學發光免疫測定法（electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA）顯現蛋白條帶。用Scion Image 4.0軟件（美國Scion公司）分析各時間段條帶的光密度值，以β微管蛋白（β-tubulin）作為內參，計算各組ANXA1蛋白的相對表達量。

1.6 統計學分析

所有數據采用SPSS 19.0進行統計學分析，蛋白表達相對水平采用±s表示，細胞陽性率用百分率表示。ANXA1表達量的組間比較采用單因素方差分析，檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 蘇木素-伊紅染色和免疫組織化學染色

與對照組（圖1A）相比：中性粒細胞于傷后6h開始出現在創口的周圍，傷后12h增多（圖1B），于傷后3 d開始減少。單核細胞于傷后1 d聚集于傷口的邊緣，其數量于傷后3 d達到峰值（圖1C）。成纖維細胞于傷后3 d開始出現在傷口底部，于傷后5 d增多（圖1D），傷后7d達到峰值。肉芽組織形成于傷后5～10 d，其內可見成纖維細胞和豐富的新生毛細血管（圖1E）；在傷后10～14d，表皮完全覆蓋創口，肉芽組織開始向瘢痕組織轉變，可見新生毛細血管和成纖維細胞數量減少，間質增多（圖1F）。

在免疫組織化學染色中，對照組皮膚的表皮、毛囊（圖2A）、皮脂腺、血管內皮表現出ANXA1陽性染色，未見假陽性染色。在實驗組的皮膚切創及周邊區，ANXA1的陽性染色在傷后6～12 h主要出現在中性粒細胞和少量單核細胞中，在傷后1～3d主要出現在單核細胞中（圖2B），而在傷后5～10d，其陽性表達主要出現在新生毛細血管內皮、成纖維細胞和少量單核細胞中（圖2C～D）。傷后14 d，新生的表皮及少量成纖維細胞仍有ANXA1陽性表達。

從ANXA1陽性細胞數與所募集到的細胞總數的比值上看：在傷后6h～7d，與對照組相比，實驗組的陽性細胞率顯著增加（P＜0.05）；在傷后6h～3d，ANXA1陽性細胞數與細胞總數的比值超過了40%，且在1 d時達到峰值，超過了60%（表1）。

表1 ANXA1在對照組和實驗組中的陽性細胞率（n=5，±s，%）

表1 ANXA1在對照組和實驗組中的陽性細胞率（n=5，±s，%）

注：1）與對照組比較，P＜0.05

陽性細胞率29.87±1.44 49.53±2.761）55.91±1.151）62.16±2.231）42.58±2.091）37.71±4.551）34.79±6.431）30.58±3.06 33.52±2.94組別對照傷后6h傷后12h傷后1d傷后3d傷后5d傷后7d傷后10d傷后14d

2.2 蛋白質印跡結果

圖3和表2結果表明，在對照組和實驗組均有ANXA1條帶，于損傷后6h開始上升，在1d時達到高峰，之后逐漸下降。實驗組與對照組的相對值單因素方差分析顯示，實驗組ANXA1在6h～3d的表達與對照組相比差異有統計學意義（P＜0.05）。另外，ANXA1相對于β-tubulin的表達強度，在傷后6 h時，與對照組相比數值明顯上升（P＜0.05），在1d時達到峰值，超過了1.0，在其他時間段內，蛋白相對表達強度均低于1.0。

圖3 各時間段ANXA1的蛋白質印跡結果

表2 ANXA1在對照組和實驗組中的蛋白相對表達量（n=5，±s）

表2 ANXA1在對照組和實驗組中的蛋白相對表達量（n=5，±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05

相對表達量0.63±0.07 0.83±0.041）0.91±0.061）1.02±0.051）0.90±0.061）0.72±0.07 0.67±0.06 0.59±0.08 0.61±0.08組別對照傷后6h傷后12h傷后1d傷后3d傷后5d傷后7d傷后10d傷后14d

3 討 論

ANXA1是位于細胞質的鈣和磷脂結合蛋白，由348個氨基酸組成，其N端結構域具有酪氨酸和絲氨酸激酶的磷酸化位點以及糖基化和轉谷氨酰胺位點。當細胞活化后，ANXA1可以通過自分泌和旁分泌機制分泌到胞外[11]。ANXA1是糖皮質激素抗炎癥作用中的重要介質，糖皮質激素可以通過上調ANXA1的表達來抑制細胞的黏附作用及中性粒細胞的遷移[2，12-13]，同時ANXA1也是參與內源性抗炎癥途徑的重要調節分子。ANXA1的抗炎癥作用主要通過甲酰基肽受體（formyl peptide receptor，FPR）信號通路實現調控。ANXA1及其N端活性片段Ac2-26可以作為激動劑來激活FPR2，調節絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和T細胞受體信號通路，抑制激活蛋白1（activator protein 1，AP1）、核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）和活化T細胞的核因子（nuclear factor of activated T cell，NFAT）等的活性，從而抑制促炎性細胞因子的作用以及增加抗炎癥因子合成[2]。

本研究免疫組織化學染色結果顯示，ANXA1在各組樣本的表皮、毛囊、皮脂腺、血管內皮均表現出陽性，與SAITO等[14]的實驗結果一致，提示ANXA1可能參與了皮膚穩態的調節。各實驗組和對照組相比，ANXA1的細胞陽性率顯著增高，于傷后1d達到峰值。傷后6 h～1 d，ANXA1在浸潤的中性粒細胞和單核細胞呈現較高的陽性率。MORAND等[15]通過流式細胞術研究了人類白細胞亞群中ANXA1的存在，發現在單核細胞和中性粒細胞中ANXA1含量最高，在淋巴細胞含量最低。PERRETTI等[2，16]研究發現，在人和小鼠的中性粒細胞、單核細胞和巨噬細胞的細胞質中含有高水平的ANXA1。本實驗結果與以上研究一致，表明ANXA1在中性粒細胞和單核細胞中高表達。既往研究結果[17]顯示，炎癥開始后，中性粒細胞和單核細胞相繼進入炎癥區域，釋放促炎性細胞因子并激活抗炎癥反應。因此，綜上研究結果提示，ANXA1可能參與到皮膚創口愈合炎癥反應的調控。

此外，本研究結果顯示，ANXA1的細胞陽性率于傷后3d開始下降。傷后3d的損傷周圍仍可見較多單核細胞表達ANXA1，傷后5～14d的損傷周圍ANXA1主要表達于成纖維細胞。從法醫病理學應用的角度，ANXA1在創口愈合中的表達呈現一定的時間規律性，可用于損傷時間的推斷。傷后6h～3d，細胞陽性率大于40%；傷后12 h～1 d，細胞陽性率大于55%；傷后1d，細胞陽性率大于60%。為了進一步明確ANXA1表達的時序性變化，本研究使用蛋白質印跡法檢測了其蛋白表達的相對水平。ANXA1蛋白表達水平與其細胞陽性率變化趨勢基本一致，于傷后1 d達到峰值。本研究提示，ANXA1表達的時間規律性可為皮膚創口形成時間的推斷提供參考依據，有望成為一種用于推斷創口形成時間的生物學指標。

在法醫學鑒定實踐中，損傷時間的準確推斷可以為判斷案情提供線索和依據。近年來，尋找與損傷時間具有良好相關性的指標成為法醫學研究的熱點。經研究[18]證實，參與皮膚創口愈合的一些細胞因子可用于創口形成時間的推斷。如白細胞介素（interleukin，IL）1a的細胞陽性率大于30%提示損傷時間為4h～1d，IL-8的細胞陽性率大于50%提示損傷時間為1～4d，人單核細胞趨化蛋白-1（human monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）的細胞陽性率大于30%提示損傷時間為1～7 d，巨噬細胞炎性蛋白1α（macrophage inflammatory protein 1α，MIP-1α）的細胞陽性率大于40%提示損傷時間為1～9d，VEGF的細胞陽性率大于50%提示損傷時間為7～14 d，氧調節蛋白150（oxygen regulated protein-150，ORP-150）的細胞陽性率大于40%提示損傷時間為7～21d。此外，基質金屬蛋白酶2（matrix metalloprotein 2，MMP2）和MMP9、CC趨化因子配體2（CC chemokine ligand 2，CCL2）和CCL3、IL-1b和IL-6以及腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor α，TNFα）的mRNA水平的時序性變化也有助于損傷時間的推斷[19]。本研究發現，ANXA1在皮膚損傷后的炎癥階段廣泛表達于中性粒細胞和單核細胞，適合于創傷早期的創口形成時間的推斷，尤其是1d左右的創口損傷時間的推斷。因此，綜合檢測多種細胞因子及ANXA1的表達，可以進一步增加皮膚創口形成時間推斷的精確性，縮小損傷時間推斷的誤差。但本研究結果基于易受控制的動物實驗，僅提供了ANXA1可用于創口形成時間推斷的實驗依據。后續還應在實際檢案中搜集不同時間的創口樣本，檢測ANXA1的表達，以探究ANXA1在實際檢案中的適用性。