犬細小病毒病實驗室診斷方法建立與分析

張 磊，張愛國，連輝霞，李四豪

(1.河南牧業經濟學院，河南 鄭州 450011; 2.漯河市郾城區畜牧局，河南 漯河 462000；3.鄭州小俏皮寵物醫院，河南 鄭州 450011)

犬細小感染是由犬細小病毒引起的一種急性、熱性、傳染性烈性疾病，臨床上以嚴重急性腸炎綜合征和非化膿性心肌炎綜合征為特征，是一類僅次于犬瘟熱的一種傳染病。20世紀70年代末發現的一種由犬細小病毒引起的出血性腸道傳染病，對犬危害極大[1]。1977年，美國學者Eugster和Nairn最先從患有出血性腸炎的病犬糞便中分離到該病毒顆粒，隨后加拿大、澳大利亞、法國等均有犬細小病毒病感染的報道[2]。1982年，梁士哲等[3]最早報道了類似CPV-2所致的犬出血性腸炎。1983年，徐汗坤等[4]正式報道了本病的發生，其主要特征是腸炎型先嘔吐后拉稀，繼而拉血便，氣味腥臭難聞，心肌炎型突發心力衰竭，呼吸困難，血液學檢查白細胞顯著低于正常范圍，犬細小病毒以其傳播范圍廣、傳染性強、感染率高、死亡率高等特點，成為犬行業中最嚴重的傳染病之一。

1 試驗材料和方法

1.1 樣本的采集

2017年12月-2018年5月，從鄭州小俏皮寵物醫院收集40例疑似犬細小病毒病例病料、犬瘟熱病毒陽性病料、犬冠狀病毒陽性病料、犬副流感病毒陽性病料等，患犬年齡從20天到5歲不等，收集后冷藏保存。

1.2 試劑及儀器設備

犬細小病毒抗原快速檢測試劑盒(北京林特睿檢有限公司)，犬細小病毒抗原熒光免疫定量分析儀(RS-6600型)(江蘇雷森生物科技有限公司)，犬細小病毒抗原(CPV-Ag)(江蘇雷森生物科技有限公司)，PCR儀(力康生物醫療科技控股有限公司)，DNA提取試劑盒、平衡緩沖液BL、裂解緩沖液、洗液W1、洗液W2、DNA洗脫液、2×PCR Taq mix DNA Marker酶(均購置寶生物工程大連有限公司)，超微量紫外分光光度計(上海美普達儀器有限公司)。

1.3 引物設計與合成

根據GenBank中發表的犬細小病毒基因序列，采用序列分析軟件進行分析，CPV-b株型設計引物如下：上游：5’-CAGCAAGCCAAGCAATC-3’，下游：5’-GCGGCGTCAGAAGGGTTA-3’，引物有北京華大基因研究中心合成。

1.4 糞便樣品的采集與處理

本試驗所用的樣品均是在鄭州寵物醫院收集，收集那些臨床癥狀出現高熱、嘔吐、拉血便的患犬糞便，并通過CPV抗原檢測試劑盒檢測，結果顯示為弱陽性或強陽性的10份樣品，樣品經沉淀處理后吸取上清液，冷藏保存。

1.5 病毒DNA提取

1.5.1樣品處理

吸取0.5mL的糞便樣品上清液，轉入到新的1.5mL離心管，5000rpm離心1～2min，棄上清。接著向1.5mL離心管的沉淀中加入1mL勻漿緩沖液，輕微吹打混勻后，5000rpm離心1～2min，棄上清。

1.5.2DNA分離

向沉淀中加入400μL裂解緩沖液，輕輕的上下顛倒混勻6～8次，室溫靜置5min,5000rpm離心2min，將上清全部轉入吸附柱，室溫靜置2min,12000rpm離心45s，離心完成后倒掉收集管廢液，向柱中加入500μL洗液W1，12000rpm離心45s，倒掉收集管廢液，12000rpm離心2min，打開收集管蓋室溫靜置10min，將吸附柱放入一個干凈的1.5mL離心管中，向吸附膜的中間部位滴加50μL-100μL DNA洗脫液，室溫放置5min，12000rpm離心1min，反復2次，保留收集管，冷藏保存。

1.6 PCR產物擴增及鑒定

PCR反應混合液總體積20μL：2×Taq PCR10μL，上下引物各1μL，模板DNA2μL，ddH2O6μL。反應條件：95℃預變性5min，98℃變性10s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環，4℃保存。反應結束后，吸取擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察并記錄結果。

2 實驗結果

2.1 犬細小病毒抗原快速檢測試紙條結果

2.1.1CPV抗原檢測試劑盒的簡便、快速試驗結果

5～10min可顯示結果，該試紙條操作簡單，快速判斷結果。

2.1.2CPV抗原檢測試紙條的敏感性試驗

用犬細小病毒抗原檢測試紙條，對一個弱陽性CPV(圖1)樣本稀釋到不同濃度進行檢測，當檢測極限為1：1000時，不再出現陽性結果，但其結果不能得到在1000倍稀釋下糞便中含有多少病毒，該CPV抗原檢測試紙條只能定性的檢測CPV。

2.1.3CPV抗原檢測試紙條的特異性試驗

從收集的犬瘟熱陽性病例樣本稀釋液通過犬細小病毒抗原試紙條進行檢測，結果顯示為陰性。同樣的試驗用犬冠狀病毒陽性病料，犬副流感病毒陽性稀釋液進行試紙條檢測，也是同樣的結果，分析結果得出兩種不同抗原不具有相同部分或抗原表位，說明CPV試紙條特異性高。

圖1 試紙條檢測CPV為弱陽性樣本

2.1.4犬細小病毒抗原檢測試劑盒假陽性或假陰性

假陽性試驗：根據犬細小病毒抗原檢測試劑盒操作說明書進行，對收集的40份臨床糞便樣本進行檢測，CPV陽性率為82.5%，將同樣的40份糞便樣本離心沉淀后吸取上清液進行檢查，陽性率為75%。結果表明，糞便沉淀處理過后再檢測，陽性率降低，說明未處理過的病例樣本有些不是陽性，也說明CPV抗原快速檢測試紙條存在假陽性，結果如下，見表1。

表1 試紙條假陽性試驗

假陰性試驗：有些患犬發病正處于潛伏期，經過試紙條檢測結果為陰性，可進行PCR檢測。取40份經試紙條檢測離心沉淀處理后的10例為陰性的樣本，進行PCR試驗。結果所示(表2)，10例陰性樣本中，經PCR檢測存在1例陽性，陽性率10%，可試紙條在一些條件下存在假陰性，PCR方法檢出1例陽性，說明PCR優于犬細小病毒抗原試紙條，PCR敏感性是高于犬細小病毒抗原檢測試紙條。

表2 試紙條與PCR試驗比較

2.2 犬細小病毒抗原熒光免疫定量分析儀檢測結果

2.2.1 犬細小病毒抗原熒光免疫定量分析儀敏感性試驗

用犬細小病毒抗原熒光定量分析儀對一個弱陽性樣本糞便按照1:10稀釋至不同濃度進行檢測，樣本稀釋至1000倍時，CPV試紙條檢測不再出現陽性，進行犬細小病毒抗原熒光免疫定量分析，結果檢測出病毒含量為15.08AU(圖2)。

圖2 CPV-Ag熒光免疫分析儀敏感性試驗

2.2.2 犬細小病毒抗原熒光免疫定量分析儀檢測CPV結果

表3 犬細小病毒抗原熒光免疫定量檢測40例樣本

2.2.3 犬細小病毒抗原熒光免疫定量分析儀特異性試驗

從收集的犬瘟熱陽性病例樣本稀釋液、犬冠狀病毒陽性病料、犬副流感陽性稀釋液進行犬細小病毒熒光定量檢測，結果顯示無交叉反應。

2.3 PCR試驗結果

2.3.1 PCR特異性檢測

用從收集的臨床病例樣本1-犬細小病毒，樣本2-犬細小病毒，樣本3-犬瘟熱病毒，樣本4-犬冠狀病毒，樣本5-水作為陰性對照，由圖3可見樣本1，樣本2能夠擴增出特異性片段，樣本3，4，5沒有任何條帶，說明PCR檢測細小病毒具有特異性。

圖3 PCR特異性試驗結果注：M,Marker；1，CPV；2，CPV；3，CDV；4，CCV；5，水

2.3.2 PCR靈敏性檢測

按照以上操作方法將提取的一例弱陽性患犬細小病毒DNA進行試驗，通過儀器檢測可檢測出大約15.7 ng/uL的病毒DNA(如圖4)，結果表明，將糞便樣品上清液稀釋104倍以后仍能擴增出CPV 特異性基因片段。

圖4 超微量紫外分光光度計檢測結果

2.3.3 PCR重復性檢測

將收集的10份陽性患犬細小病毒的糞便樣本按照以上操作方法進行操作，重復三次，并對這三次結果進行分析，結果表明，均得到相同的結果，說明該方法重復性好。

2.4 犬細小病毒抗原快速檢測試紙條與PCR比較

表4 CPV與PCR試驗比較

由表4可知，PCR陽性率低于試紙條,對此結果存在一些問題，再進行臨床治療效果對比試驗，對40個犬細小病毒抗原診斷試劑盒診斷為陽性的病例臨床效果進行跟蹤調查，結果如表5所示,犬細小病毒抗原試紙條診斷為陽性的病例陽性率為66.3%，PCR診斷出27例陽性,陽性率為56.7%。

2.5 犬細小病毒抗原(CPV-Ag)熒光免疫定量分析儀與PCR 的比較

表5 試紙條與PCR試驗比較

表6 CPV-Ag與PCR試驗比較

2.6 犬細小病毒抗原快速檢測試劑盒與犬細小病毒抗原熒光免疫定量分析儀比較

表7 CPV試紙條與CPV-Ag熒光定量分析儀比較

3 討論

3.1 犬細小病毒抗原快速檢測試劑盒與PCR試驗結果的討論與分析

如表4所示，CPV陽性率高于PCR方法，但根據以往學習的理論知識可知PCR敏感性要高于試紙條。所以對此進行了表5的犬細小病毒病臨床治療效果的跟蹤調查，結果顯示，試紙條為陽性的病例的陽性率為66.3%，PCR診斷出27例陽性的，其陽性率為56.7%。結果說明，犬細小病毒抗原診斷試紙條檢測到的某些弱陽性病例不一定就是犬細小病毒。PCR檢測結果準確率是要高于試紙條，由表5證明了試紙條存在假陽性或假陰性，這與糞便樣品未沉淀處理有關，未處理糞便中存在一些復雜物質，會干擾試紙條的檢測，導致假陽性結果的產生。

3.2 犬細小病毒熒光免疫定量分析儀與PCR 試驗結果的討論與分析

由表6可知，40例樣本中，CPV-Ag熒光免疫定量分析儀檢測到25例陽性，陽性率為62.5%，PCR方法檢測到27例陽性，陽性率67.5%，可知PCR陽性率高于CPV-Ag熒光免疫定量分析儀，準確性高于CPV-Ag熒光免疫定量分析儀，PCR更優于檢測犬細小病毒。

3.3 犬細小病毒抗原快速檢測試劑盒與犬細小病毒抗原熒光免疫定量分析儀比較

在40例樣本中，表7中CPV試紙條檢測33例陽性，陽性率為82.5%，CPV-Ag熒光定量分析儀檢測25例陽性，陽性率為62.5%，結果顯示，CPV-Ag熒光免疫定量分析儀陽性率低于CPV試紙條，說明CPV試紙條是定性檢測犬細小病毒，存在假陽性，而CPV-Ag熒光免疫分析儀是定量檢測。在臨床中經犬細小病毒抗原快速檢測試劑盒檢測兩次都為陰性，最后經犬細小病毒抗原熒光免疫定量分析儀檢測顯示為弱陽性，可知其敏感性高于犬細小病毒抗原快速檢測試劑盒。

4 結論

犬細小病毒抗原快速檢測試劑盒存在假陽性或假陰性，而且只能定性檢測犬細小病毒，但操作簡單，時間短，結果顯而易見，且成本不高。犬細小病毒抗原熒光免疫檢測分析儀能在15 min定量檢測犬糞便中細小病毒具體含量，且敏感性高于犬細小病毒抗原試紙條，但成本稍高。在犬細小病毒抗原性速檢測試劑盒和犬細小病毒抗原熒光免疫定量分析儀檢測不出時，PCR具有更高的敏感性，而且感染早期就能實現病毒的快速檢測，但它需要昂貴的設備，而且反應時間長。臨床檢測中，可以根據需要將三種試驗方法進行結合，更利于診斷的準確性。