核酸檢測法與酶聯免疫吸附法在乙型肝炎病毒血清學檢驗中的應用分析

畢玉超* 王 吉 任 瑩 陳慧博

（1 朝陽市中心血站，遼寧 朝陽 122000；2 吉林大學第二醫院，吉林 長春 130062）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是危害人類健康的主要病原體之一，也是經血液傳播的主要病原體之一。它具有發病率高、潛伏期長、攜帶率高等特點。我國是HBV流行的高發地區，人群攜帶率約為10%，這已成為了我國嚴重的公共衛生問題之一[1]。目前，檢測HBV感染最常用的指標是對血清中乙型肝炎表面抗原（HBsAg）的檢測。實驗室常用的檢出方法是酶聯免疫吸附法（ELISA），它可以大大降低輸血感染HBV的風險，但由于有HBV“窗口期”和隱匿性HBV感染的存在，被輸血者仍有感染HBV的風險存在。核酸檢測PCR（nucleic acid test PCR，NAT PCR）是融合了PCR和DNA探針的雜交技術，采用熒光技術和閉管檢測，直接檢測PCR過程中的熒光信號變化[2-3]。將它應用到HBV的檢測中，對血液標本中的HBV-DNA進行檢測。本文探討了NAT PCR與酶聯免疫吸附法（ELISA）在乙型肝炎病毒血清學檢驗中的應用，報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源：朝陽市中心血站2017 年1月1日至2017年12月31日期間檢測的無償獻血者血液樣本。核酸標本現場離心分離出血漿，樣本采用乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）抗凝真空采血管采集。采用5 mL普通抗凝管（江蘇康健公司）用于ELISA法檢測，5 mL核酸分離膠管（上海力因精準醫療）用于NAT PCR法檢測，將樣本置于2～8 ℃冰箱中儲存。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 酶聯免疫檢測法：試劑采用英科新創和珠海麗珠兩個廠家的乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒進行兩遍檢測。設備采用全自動樣本處理系統Freedom EVO Clinical（瑞士帝肯公司）進行樣本處理，全自動酶免分析系統Microlab FAME24/20（煙臺澳斯邦生物）進行酶免分析處理。

1.2.2 核酸檢測法：試劑采用上海浩源生物科技生產的乙型肝炎病毒核酸檢測試劑盒（PCR-熒光法）進行血液標本的HBV DNA的篩查檢測。設備采用ChiTas BSS 1200檢測分析系統進行樣本匯集、核酸提取、PCR創建。ABI 7500進行擴增檢測。

1.3 方法

1.3.1 酶聯免疫檢測：采用不同人員使用不同儀器、試劑分別進行HBsAg項目的檢測。本站HBsAg項目設置灰區為0.7，即s/co值＜0.7為無反應性，s/co值≥0.7為反應性。雙試劑均無反應性判定為合格，雙試劑反應性判定為不合格，單試劑反應性判定為待查。待查標本采用有反應性的試劑進行雙孔復試。復試兩孔均無反應性判定為合格，復試兩孔中有任一孔為反應性則判定為不合格。

1.3.2 核酸檢測法：采用上海浩源系統對酶免檢測合格的標本進行8人份混樣檢測。對HBsAg項不合格標本進行單檢。根據Ct值（指每個反應管內的熒光信號達到設定的閾值時所經歷的循環數）進行結果的判定。Ct值＞45為無反應性，Ct值≤45為反應性。混檢結果無反應性判定為合格，混檢有反應性需要進行拆分檢測（單檢），拆分無反應性判定為合格，拆分反應性判定為不合格。單檢無反應性判定為合格單檢有反應性判定為不合格。

1.4 統計學處理：應用SPSS18.0軟件進行數據統計分析，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 血清學檢測結果：本研究使用兩種不同品牌的ELISA試劑盒對2017年的全部無償獻血者血清標本27855份進行檢測，其中不合格標本數（率）為370份（1.33%），其中HBsAg不合格數（率）為52份（0.19%）。

2.2 HBV的NAT PCR與ELISA的檢測結果比較：利用NAT PCR對2017年全部血清標本進行檢測，結果如表1所示， HBV-DNA檢測不合格標本數為64份（0.23%）。對NAT PCR與ELISA檢測HBV的結果進行比較，兩種檢測方法的差異具有統計學意義（χ2=16929.58，P＜0.05）。

表1 遼寧省朝陽市2017年血液標本NAT PCR法與ELISA法對HBV檢測結果比較

3 討 論

目前在臨床上，ELISA仍然是檢測HBV血清學標志物的主要方法，該方法靈敏度可達（0.05～0.5）ng/mL[4]，它還具有操作簡便、檢測迅速、價格低廉等特點[5]，而被廣泛應用在無償獻血的篩查工作中。采用該法對血液標本進行篩查后，輸血傳播HBV的風險已得到了明顯控制。但由于有HBV“窗口期”和隱匿性HBV感染的存在，以及其檢驗結果中假陰性和假陽性結果的存在[6-8]，使被輸血者仍有感染輸血后HBV的風險存在。隨著核酸檢測技術的發展，NAT PCR法以其靈敏度高，特異性好及窗口期短的特點，在血液篩查工作中應用越來越廣泛。

本研究發現在遼寧省朝陽市2017年27855份血液標本中，經ELISA檢測為陽性的標本數為52份（0.19%），經NAT PCR檢測為陽性的標本數為64份（0.23%），兩種檢測方法經方差分析差異具有統計學意義。這說明只用ELISA檢測的HBsAg可能不能完全反應HBV病毒在血液中的存在情況。它需要NAT PCR法進行復檢，以確保檢測結果的準確性。雖然，NAT PCR法存在著檢測費用高，需要特殊的儀器設備的問題，使它不能完全取代血清學標志物的地位，但它能更準確的反應HBV的感染情況。

綜上所述，將ELISA與NAT PCR法聯合使用，可以有效的提高檢測的靈敏度，進而提高輸血的安全系數,這也與其他文獻報道相一致[9-10]。